韓善橋，趙曉航，石 峰，史成和

（中國人民解放軍海軍總醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心，北京100048）

金黃色葡萄球菌存在于人體鼻黏膜、皮膚及腸道等部位，是化膿性感染的常見病原菌之一，除引起癤、癰、膿腫等局部感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心內(nèi)膜炎和膿毒血癥等全身感染。金黃色葡萄球菌為侵襲性細(xì)菌，能產(chǎn)生腸毒素，對腸黏膜損傷性大，所致腸炎起病急，中毒癥狀重，主要表現(xiàn)為嘔吐、發(fā)熱、腹瀉等，因此，金黃色葡萄球菌快速檢測對臨床及時診治具有重要意義。分離培養(yǎng)法鑒定金黃色葡萄球菌操作復(fù)雜，檢測周期長且需細(xì)菌檢驗人員，難以在實驗室之外的特殊環(huán)境下進(jìn)行。用測試片法鑒定金黃色葡萄球菌操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確［1－4］。金黃色葡萄球菌測試片現(xiàn)應(yīng)用于食品衛(wèi)生的檢測，用于臨床標(biāo)本的檢測尚未見報道。本研究擬在探討金黃色葡萄球菌測試片在檢測臨床標(biāo)本中的應(yīng)用情況，為在特殊情況下進(jìn)行金黃色葡萄球菌感染的快速檢測提供幫助。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株來源 金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、無乳鏈球菌、糞腸球菌、藤黃微球菌、大腸埃希菌、鼠傷寒沙門菌、福氏志賀菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、阪崎腸桿菌、肺炎克雷伯菌、弗氏檸檬酸桿菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌、空腸彎曲菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌和嗜水氣單胞菌，均購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 檢測標(biāo)本來源 檢測標(biāo)本來自臨床，包括尿液40份、腹水15份、傷口分泌物20份。

1.3 儀器與耗材 VITEK2Compact全自動微生物分析儀，法國生物梅里埃公司產(chǎn)品。金黃色葡萄球菌測試片購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司（在有效期內(nèi)使用）。培養(yǎng)基包括胰蛋白胨大豆肉湯、腦心浸出液肉湯、布氏肉湯、血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、胰蛋白胨大豆瓊脂和3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂，均購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司（在有效期內(nèi)使用）。

1.4 方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇 將金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌和無乳鏈球菌等標(biāo)準(zhǔn)菌株按操作說明進(jìn)行復(fù)蘇。

1.4.2 測試片定量檢測 吸取標(biāo)本1mL 于無紡布棉墊上，待液體吸收后，輕輕蓋上薄膜并將邊緣推平，將測試片正面平放于溫箱中，35 ℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。

1.4.3 測試片定性檢測 揭開測試片薄膜，吸取1 mL 無菌生理鹽水于無紡布棉墊上，待液體吸收后，接種待測標(biāo)本，蓋上薄膜并將邊緣推平，將測試片正面平放于溫箱中，35℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長情況。

1.4.4 測試片靈敏度試驗 制備金黃色葡萄球菌新鮮菌液，用無菌生理鹽水將菌懸液濃度稀釋為10－5、10－6、10－7、10－8和10－9倍，分別吸取不同濃度菌懸液1.0 mL，接種測試片和胰蛋白胨大豆瓊脂平板，35 ℃培養(yǎng)24h，觀察培養(yǎng)結(jié)果。

1.4.5 測試片特異性試驗 制備金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌和無乳鏈球菌等26種標(biāo)準(zhǔn)菌株新鮮菌液，用無菌生理鹽水稀釋成10－5倍菌懸液，分別吸取不同標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液1.0mL接種測試片，35 ℃培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌生長情況。

1.4.6 標(biāo)本接種 根據(jù)不同標(biāo)本選擇最佳接種方法，35 ℃培養(yǎng)24h。（1）測試片直接接種標(biāo)本：對于液體標(biāo)本（尿液、腹水、腦脊液），直接接種標(biāo)本1mL；（2）測試片加無菌生理鹽水再接種標(biāo)本：對于拭子取樣標(biāo)本，先將測試片加無菌生理鹽水1 mL，再接種標(biāo)本；（3）標(biāo)本經(jīng)倍比稀釋再接種：對于定量實驗或標(biāo)本中細(xì)菌數(shù)多，應(yīng)將標(biāo)本作10倍倍比稀釋再接種。

1.4.7 測試片最佳培養(yǎng)時間觀察試驗 將測試片接種金黃色葡萄球菌后，在35 ℃溫箱分別培養(yǎng)15、18、24和30h，觀察細(xì)菌生長情況，選擇最佳培養(yǎng)時間。

1.4.8 測試片穩(wěn)定性試驗 將測試片完整包裝分別存放在4 ℃冰箱、25 ℃室溫和35 ℃孵箱3個不同溫度下，每7d檢測1次，共檢測2次。

1.4.9 細(xì)菌鑒定 將臨床標(biāo)本分別接種測試片、血瓊脂平板或胰蛋白胨大豆瓊脂平板，35 ℃培養(yǎng)24h，血瓊脂平板或胰蛋白胨大豆瓊脂平板生長的細(xì)菌，使用全自動微生物分析儀鑒定。

1.4.10 測試片結(jié)果判定 測試片出現(xiàn)藍(lán)綠色菌落為金黃色葡萄球菌，為陽性結(jié)果；測試片為無色或未見藍(lán)綠色菌落為陰性結(jié)果。如果尿液中金黃色葡萄球菌數(shù)大于或等于104CFU／mL，可診斷泌尿道感染。如傷口分泌物中金黃色葡萄球菌數(shù)大于或等于103CFU／mL，表明傷口可能發(fā)生細(xì)菌感染。對于特殊體液標(biāo)本（如腹水、腦脊液、關(guān)節(jié)液），如測試片上有細(xì)菌生長，則表明相應(yīng)部位可能有細(xì)菌感染。

2 結(jié) 果

2.1 測試片靈敏度試驗 金黃色葡萄球菌測試片對其純菌液檢測下限為1CFU／mL，當(dāng)臨床標(biāo)本中金黃色葡萄球菌為大于或等于1CFU／mL時，測試片即可顯示陽性結(jié)果，見表1。

表1 金黃色葡萄球菌測試片靈敏度試驗結(jié)果（CFU／mL）

2.2 測試片特異性試驗 在被檢測的26種細(xì)菌中，除金黃色葡萄球菌呈藍(lán)綠色菌落，表皮葡萄球菌呈黑色菌落外，其余24種非目的菌（糞腸球菌、藤黃微球菌、無乳鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、大腸埃希菌、產(chǎn)氣腸桿菌、陰溝腸桿菌、阪崎腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌、鼠傷寒沙門菌、福氏志賀菌、空腸彎曲菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、嗜水氣單胞菌、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌）在測試片上均不生長。

2.3 細(xì)菌復(fù)活試驗 將測試片上的藍(lán)綠色菌落接種到血瓊脂平板上，35 ℃培養(yǎng)24h，細(xì)菌生長良好。表明測試片上生長的細(xì)菌可以保留菌種，進(jìn)一步做細(xì)菌藥敏試驗及流行病學(xué)調(diào)查。

2.4 最佳培養(yǎng)時間試驗 培養(yǎng)24h 后觀察結(jié)果比較好，見表2。

表2 不同培養(yǎng)時間金黃色葡萄球菌在測試片上的檢出率

2.5 測試片儲存穩(wěn)定性試驗 金黃色葡萄球菌均能在培養(yǎng)24h后出結(jié)果，與4 ℃存放檢測菌落數(shù)符合率在92%以上，見表3。

表3 不同存放時間和溫度對測試片檢測結(jié)果的影響

2.6 臨床標(biāo)本檢測試驗 測試片法與分離培養(yǎng)法的陽性結(jié)果一致，見表4。

表4 測試片法與分離培養(yǎng)法檢測臨床標(biāo)本結(jié)果比較（n）

3 討 論

傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法細(xì)菌鑒定需要對標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)，待分離出純菌落后，才能進(jìn)行細(xì)菌鑒定，雖然此方法經(jīng)典、可靠，但操作復(fù)雜、時間長，且需要在有條件的實驗室和細(xì)菌檢驗人員才能開展［5－7］。顯色培養(yǎng)基是利用細(xì)菌產(chǎn)生的特異酶與相應(yīng)底物（由產(chǎn)色基團(tuán)和細(xì)菌可代謝物質(zhì)組成）反應(yīng)而顯色，直接觀察菌落顏色進(jìn)行鑒定［8－9］，但仍需配制培養(yǎng)基和高壓滅菌，也不適合在野外和艦船上開展。測試片法鑒定細(xì)菌是以紙片、無紡布或冷水可凝膠等替代瓊脂作為載體，采用選擇性培養(yǎng)基和特異性的酶顯色劑作為主要原料，制成的一次性細(xì)菌快速鑒定產(chǎn)品［10］。它是在分離培養(yǎng)法和顯色培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的一項新技術(shù)，與分離培養(yǎng)法相比，測試片法克服了分離培養(yǎng)法在細(xì)菌培養(yǎng)、分離、鑒定等操作中比較復(fù)雜的缺點，只需加樣培養(yǎng)24h，直接觀察菌落顏色，即可對細(xì)菌作出鑒定，不需配制培養(yǎng)基，操作簡單，便于攜帶，檢測時間短，非檢驗人員均可操作，特別適合在艦船遠(yuǎn)航及野外環(huán)境等特殊情況下開展。但細(xì)菌測試片法也存在一定不足，如測試片加樣后馬上蓋上薄膜，液體易溢出；測試片種類比較少，只能檢測十幾種常見細(xì)菌；對于一些混合細(xì)菌感染的標(biāo)本，使用一種測試片不能同時檢測和鑒定多種病原菌等。

金黃色葡萄球菌測試片具有良好的特異性，在被測定的26種細(xì)菌中，除金黃色葡萄球菌呈藍(lán)綠色菌落、表皮葡萄球菌呈黑色菌落外，其余24種非目的菌均不生長。金黃色葡萄球菌測試片靈敏度高，對純菌的檢測靈敏度可達(dá)1CFU／mL，對菌落數(shù)目在1～9個范圍內(nèi)的菌液，測試片法與平皿法一樣均能檢測出來。對于一些無菌部位的體液標(biāo)本，如腹水、腦脊液、關(guān)節(jié)液等，其檢出陽性結(jié)果具有一定臨床意義。用測試片法與培養(yǎng)法同時檢測臨床標(biāo)本75份，其檢測結(jié)果一致。測試片在短時間使用和運(yùn)輸中，無需采取特殊保存措施。因此，在一些特殊情況下，如野外環(huán)境訓(xùn)練、搶險救災(zāi)開展醫(yī)療服務(wù)，艦船遠(yuǎn)航進(jìn)行衛(wèi)勤保障，發(fā)生食物中毒后指導(dǎo)突發(fā)事件的處理等，金黃色葡萄球菌測試片都具有重要的應(yīng)用價值。

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