崔麗，張恩園，李廣平，楊萬松，焦占全

(天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院，天津 300211)

冠狀動脈再狹窄(RS)影響冠心病介入治療患者的長期預(yù)后，藥物洗脫支架使再狹窄率明顯降低，但仍維持在5%～12%［1，2］。動脈血管的彈性回縮、血栓形成、血管壁負性重塑及血管壁中層平滑肌細胞的增殖均參與經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)血管成形術(shù)(PTCA)術(shù)后再狹窄這一復(fù)雜的病理生理過程［3，4］。2012年12月～2014年12月，我們通過制作兔頸動脈球囊損傷模型，觀察球囊損傷后動脈內(nèi)膜、中膜厚度及面積的時相性變化，探討平滑肌細胞(VSMC)增殖在再狹窄中的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康長耳白兔60只，雌雄不限，體質(zhì)量(2.0±0.2)kg，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，標準兔料，自由攝食水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 頸動脈球囊損傷模型的建立及分組 將60只白兔隨機分為對照組(10只)及球囊損傷組(50只)，對照組正常飼養(yǎng)28 d處死。球囊損傷組先對白兔進行稱質(zhì)量，術(shù)前15 min予肝素鈉鹽水(500 U/kg)、3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)經(jīng)耳緣靜脈注射，待兔出現(xiàn)肌力下降、軟癱等麻醉反應(yīng)后，固定于實驗動物臺，常規(guī)備皮、消毒，頸部正中切口，逐層切開，分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈遠心端，血管夾夾閉頸總動脈、頸內(nèi)動脈，選用冠脈2.5 mm×15 mm球囊，自頸外動脈近心端插入球囊導(dǎo)管至主動脈弓處，連接手推式壓力泵，回拉至頸總動脈分叉處，迅速撤壓，回送至主動脈弓處，壓力為8～16 ATM共5次，導(dǎo)管撤出，結(jié)扎頸外動脈，恢復(fù)頸總動脈、頸內(nèi)動脈血流;對側(cè)只分離頸動脈，不予球囊損傷，逐層縫合傷口，慶大霉素4萬U噴灑傷口，4萬U肌注。球囊損傷術(shù)后1 h耳緣靜脈注射2 mL的0.5 mg/mL的伊文氏藍，注射后2 h處死2只，自主動脈跟部取下雙側(cè)頸總動脈血管標本，球囊損傷側(cè)血管較正常側(cè)血管擴張且著色明顯，明顯藍染，對側(cè)只有輕度著色。余48只白兔正常飼養(yǎng)至術(shù)后3、7、14、28 d，于以上時點各處死 12 只并取材。損傷側(cè)動脈段為模型組(Model組)，損傷對側(cè)頸動脈段作為假手術(shù)組(Sham組)。

1.3 動脈內(nèi)膜、中膜形態(tài)學觀察及厚度、面積測算按照實驗分組設(shè)計時間，3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)耳緣靜脈注射麻醉，頸部正中切口，沿頸總動脈向下分離至主動脈弓，向上分離至頸外動脈結(jié)扎處，生理鹽水反復(fù)沖洗，取約1.0 cm動脈段，置于新鮮配制的4%多聚甲醛、2%戊二醛磷酸緩沖液(pH 7.4)固定。石蠟包埋，間斷均勻切片，切片厚5 μm，HE染色，光鏡下觀察移行平滑肌細胞增殖和內(nèi)膜增厚情況。按組織學劃分，內(nèi)彈力膜以內(nèi)為血管內(nèi)膜，內(nèi)、外彈力膜之間為中膜。5倍物鏡下將完整的血管橫切面HE染色圖像攝入計算機圖像分析系統(tǒng)，應(yīng)用圖像處理軟件隨機選取10個點分析，測量內(nèi)膜厚度(IT)、中膜厚度(MT)，并計算血管內(nèi)膜、中膜厚度比(IT/MT);選取3個切面測量相應(yīng)內(nèi)膜面積(IA)、中膜面積(MA)，計算內(nèi)膜與中膜面積比(IA/MA)。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以表示，多組間比較進行單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 動脈內(nèi)膜、中膜形態(tài)學變化 對照組及Sham組動脈內(nèi)膜光滑完整，管腔通暢，內(nèi)膜、中膜和外膜分界清楚。內(nèi)膜和中膜以波浪狀完整連續(xù)的內(nèi)彈力板為界，中膜層為4～6層平滑肌細胞同心圓排列，周圍可見彈力纖維組織。Model組術(shù)后3 d，內(nèi)皮細胞脫落，暴露內(nèi)皮下的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)膜表面炎性細胞浸潤，中層彈力纖維增多。Model組術(shù)后7 d，部分內(nèi)彈力板斷裂，內(nèi)膜輕度增厚，中層平滑肌細胞數(shù)目增多，彈力纖維增多，中膜厚度增加。Model組術(shù)后14 d，新生內(nèi)膜厚度明顯增加，細胞外基質(zhì)(膠原和彈力纖維)增加，中膜厚度有所下降，管腔相對縮窄。Model組術(shù)后28 d，內(nèi)膜明顯不規(guī)則增生，增生的細胞呈梭形，少量泡沫細胞浸潤，平滑肌細胞排列紊亂，細胞外基質(zhì)大量分泌。見圖1。

圖1 各組頸動脈HE染色(×200)

2.2 動脈IT、MT、IA、MA變化 結(jié)果見表1。

表1 各組頸總動脈IT、MT、IA、MA比較()

表1 各組頸總動脈IT、MT、IA、MA比較()

注:與對照組相比，*P ＜0.05;與 Sham 組相比，ΔP ＜0.05;與 Model組損傷后3 d相比，○P ＜0.05;與 Model組損傷后7 d相比，□P ＜0.05;與 Model組損傷后14 d相比，☆P ＜0.05。

組別 n IT(μm) MT(μm) IT/MT IA(μm2) MA(μm2)IA/MA Sham 組損傷后3 d 12 2.37±0.12 52.6±1.9 0.045±0.003 6403.6± 559.5 148514± 8339 0.04±0.005損傷后7 d 12 2.35±0.09 52.3±1.8 0.045±0.002 6422.7± 552.4 151902± 8429 0.04±0.005損傷后14 d 12 2.41±0.12 52.5±1.1 0.046±0.003 6362.9± 347.7 150215±13850 0.04±0.005損傷后28 d 12 2.46±0.25 52.1±1.5 0.047±0.004 6209.3± 178.0 152270±16637 0.04±0.004 Model組損傷后3 d 12 2.33±0.30 61.1±12.2 0.039±0.006 6862.2± 1029.5 270968±75741* Δ 0.03±0.012損傷后7 d 12 8.72± 2.79 93.4±22.1* Δ○ 0.090±0.030 8577.1± 1311.1 349631±59138* Δ○ 0.03±0.004損傷后14 d 12 42.26±12.36* Δ○□ 80.8±13.5*Δ○□ 0.511±0.130* Δ○□ 105879.4±35546.1* Δ○□ 390756±112567* Δ○ 0.27±0.058* Δ○□損傷后28 d 12 132.15±35.88* Δ○□☆ 84.3±7.6* Δ○□ 1.580±0.447* Δ○□☆ 354490.6±164047.6* Δ○□☆ 521067±157346*Δ○□☆ 0.66±0.136* Δ○□☆對照組 10 2.39±0.14 52.4±1.6 0.046±0.003 6756.9± 977.9 151434±16652 0.05±0.009

3 討論

頸動脈球囊損傷模型是動脈粥樣硬化及再狹窄研究常用的動物模型［5］，本實驗中采用經(jīng)頸外動脈入路直接球囊擴張拖拉兔頸動脈造成內(nèi)皮剝脫模擬PTCA后內(nèi)皮損傷，復(fù)制再狹窄形成過程，頸部動脈易于分離、肉眼直視下操作，手術(shù)操作簡單，模型動物存活率高、重復(fù)性好，頸總動脈較長，獲得實驗組織較多，利于進一步的分子生物學及病理學實驗。此外通過注射伊文氏藍觀察損傷后血管出現(xiàn)明顯藍染，表明內(nèi)皮損傷成功，其主要機制為伊文氏藍能與血漿中蛋白完全結(jié)合，在內(nèi)皮屏障遭到破壞時進入內(nèi)皮下出現(xiàn)藍染從而反映內(nèi)皮損傷的程度［6］。

RS形成是一個復(fù)雜的病理生理過程，內(nèi)膜增生、彈性回縮、血栓、炎癥均參與其中［7，8］。本研究動態(tài)觀察損傷后頸動脈的IT及IA時相性變化，發(fā)現(xiàn)損傷3 d時內(nèi)膜表面炎性細胞浸潤，中膜彈力纖維增多，少量平滑肌細胞增殖，MA較對照組擴大，7 d時中膜平滑肌細胞數(shù)目及彈力纖維增多，MT、MA增加明顯，IT較對照組有增加趨勢，14 d時IT、IA明顯增加，而MT有所下降，28 d時IT、IA繼續(xù)增厚達高峰，MT較14 d時無明顯差異，IT/MT及IA/MA在損傷后14 d明顯增大，28 d時達高峰，表明急性損傷后3～7 d中膜血管平滑肌細胞開始明顯增殖，術(shù)后7～14 d為中膜血管平滑肌細胞向內(nèi)膜下遷移和再增殖過程，術(shù)后14～28 d內(nèi)膜增生的血管平滑肌細胞合成大量的細胞外基質(zhì)，導(dǎo)致管腔的狹窄和血管負性重塑，最終導(dǎo)致RS形成。上述結(jié)果與國內(nèi)外文獻［8～10］報道的再狹窄模型病理改變基本一致，模擬了臨床冠狀動脈成形術(shù)后的病理變化，表明經(jīng)頸外動脈入路可成功建立頸總動脈損傷模型，可用于再狹窄的病理、機制及藥物干預(yù)研究。同時內(nèi)膜時相性變化提示血管平滑肌細胞的增殖、向內(nèi)膜遷移及細胞外基質(zhì)分泌，血管負性重構(gòu)均在再狹窄形成中發(fā)揮重要作用，但更深入的分子機制尚需進一步研究。

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