杜慧靜，陳 峰，唐關(guān)敏，徐文博

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州310053； 2.嘉興市第一醫(yī)院心內(nèi)科，浙江 嘉興310053；3.嘉興市第一醫(yī)院中醫(yī)針灸科，浙江嘉興310053）

急性心肌梗死（AMI）是缺血性心臟病中死亡和致殘的主要原因［1-2］。介入是治療AMI最有效的方法，但受梗死面積及再灌注時(shí)間的限制并可能引起進(jìn)一步的心肌損傷，缺血缺氧一旦發(fā)生，會(huì)導(dǎo)致心肌壞死，繼發(fā)心律失常、心室重構(gòu)等。目前已經(jīng)證實(shí)針刺在臨床上治療心律失常為行之有效的手段［3］，且近年來的研究發(fā)現(xiàn)針刺對缺血性疾病有調(diào)節(jié)作用。本研究旨在通過研究針刺對基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-2）、組織基質(zhì)金屬蛋白酶-2（TIMP-2）的調(diào)節(jié)作用探討電針對AMI的療效及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

清潔級 SD 雄性大鼠 32只，體重（270±20）g，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK（蘇）2013-0011。適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后開始實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為正常組8只，余16只大鼠復(fù)制AMI模型，模型復(fù)制成功后隨機(jī)分為模型組和電針組各8只。

1.2 儀器與試劑

小動(dòng)物呼吸機(jī)（上海奧爾科特生物科技有限公司），LH202H型韓氏穴位神經(jīng)刺激儀（北京華衛(wèi)有限公司生產(chǎn)），生物系統(tǒng)信號(hào)采集儀（淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司），正置顯微鏡［OLYMPUS（CX41）公司］，恒溫烘箱（上海恒一科學(xué)儀器有限公司），石蠟切片機(jī)（徠克公司）。牛血清蛋白（BSA）（北京索萊寶生物科技有限公司），DAB濃縮型試劑盒（上海長島生物技術(shù)有限公司），中性樹脂（上海長島生物技術(shù)有限公司），二抗（上海長島生物技術(shù)有限公司），引物及探針（TAKARA公司），熒光定量PCR儀（Applied Biosystem），F(xiàn)TC3000HT（Funglyn Biotech Incorporated）。

1.3 造模及針刺方法

采用冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法復(fù)制大鼠AMI模型。4%水合氯醛1 mL/kg腹腔注射麻醉，四肢固定，經(jīng)口氣管盲插，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助通氣，呼吸頻率 70 次/min，潮氣量 2～3 mL，呼吸比為 1∶2。肺動(dòng)脈圓錐與左心耳交界稍下1.0～2.0 mm處用6/0線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，結(jié)扎后可見左室前壁失去原有光澤，色變蒼白，并出現(xiàn)搏動(dòng)減弱，心電監(jiān)測可見肢體導(dǎo)聯(lián)R波振幅明顯升高，ST段抬高，證實(shí)AMI模型制備成功。術(shù)后注射青霉素預(yù)防感染。電針組取大鼠雙側(cè)“內(nèi)關(guān)”“心俞”，穴位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》介紹方法選?。挥?0號(hào)半寸毫針垂直刺入2.0～3.0 mm，連接韓氏穴位神經(jīng)刺激儀，頻率2 Hz/100 Hz等幅疏密波，電流強(qiáng)度1 mA，以肢體出現(xiàn)輕微抽動(dòng)為度。每天1次，連續(xù)5 d。正常組和模型組不進(jìn)行針刺。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

心電圖檢測：將大鼠以4%水合氯醛腹腔注射麻醉固定，將針電極插入四肢皮下作為肢導(dǎo)聯(lián)的電極，連接生物系統(tǒng)信號(hào)采集儀觀察記錄標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)碾妶D，記錄各組心電圖。

免疫組化：免疫組化染色操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。在OLYMPUS光學(xué)顯微鏡下200倍放大拍照，每張切片在近梗死區(qū)隨機(jī)觀察5個(gè)視野，分析陽性表達(dá)面積。

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）：取心肌組織，用Trizol法提取RNA，檢測RNA純度及濃度，取純度好的樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，12.5 μL反應(yīng)體系，cDNA置-20℃保存?zhèn)溆?。RT-PCR反應(yīng)體系為25 μL，ddH2O：10.5 μL，SYBR Premix Ex TaqTM（2×）：12.5 μL，PCR-F（10 μM）：0.5 μL，PCR-R（10 μM）：0.5 μL，模板 cDNA：1.0 μL，反應(yīng)條件：95 ℃，1 min；40 個(gè)循環(huán)：95 ℃，10 s；64 ℃，25 s（收集熒光）；熔點(diǎn)曲線分析55℃to 95℃。每個(gè)樣本進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，與正常組進(jìn)行相對定量分析比較，計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量。以RNA18S為內(nèi)參照，對目標(biāo)基因進(jìn)行歸一化處理，比較相同樣品中目標(biāo)基因的量。采用相對定量法，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2△Ct法對樣本中的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較，測定各組MMP-2、TIMP-2相對于內(nèi)參基因表達(dá)量。RT-PCR引物及相關(guān)情況見表1。

表1 Real-Time PCR引物及相關(guān)情況

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 心電圖結(jié)果

各組心電圖檢查結(jié)果見圖1。

圖1 各組心電圖檢測結(jié)果

從圖1中可以看出，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支后，大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖上出現(xiàn)ST段上抬，T波抬高。電針5 d后大鼠心率基本恢復(fù)正常有輕度ST段異常。AMI組5 d后心電圖T波呈現(xiàn)低平狀態(tài)。

2.2 Cx43陽性表達(dá)面積

N組、AMI組、E組Cx43陽性表達(dá)面積分別為957.00±44.50，526.00±4.58，605.00±10.44。模型組Cx43陽性表達(dá)面積較正常組明顯下降（P<0.01），電針組的Cx43陽性表達(dá)面積與模型組比較有顯著上升趨勢（P<0.01）。

2.3 MMP-2、TIMP-2表達(dá)量的變化

模型組MMP-2表達(dá)量較正常組稍有上升，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型組TIMP-2的表達(dá)量較正常組顯著下降（P<0.05）。電針組MMP-2、TIMP-2的表達(dá)量與模型組比較均明顯上升（P<0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組MMP-2、TIMP-2表達(dá)量 （±s）

表2 各組MMP-2、TIMP-2表達(dá)量 （±s）

注：與正常組比較，1）P<0.05；與模型組比較，2）P<0.05

組別 n MMP-2 TIMP-2正常組 80.14±0.0324.35±13.09模型組 80.18±0.056.15±4.731）電針組 81.69±0.921） 16.11±4.642）

3 討論

急性心肌梗死典型癥狀為胸骨后或心前區(qū)壓榨樣疼痛，故依據(jù)其癥狀特點(diǎn)可歸屬于中醫(yī)的“胸痹”“真心痛”“厥心痛”。中醫(yī)認(rèn)為其病因與氣虛、血瘀、痰凝、氣滯相關(guān)。唐朝孫思邈在《千金要方》和《千金翼方》中指出“心痛暴出，絞急欲絕，灸神府百壯……”，“心痛如椎針刺，然谷、太溪主之”“心痛短氣不足以息，刺手太陰”“胸痹引背時(shí)寒，間使主之”。以上論述均為針灸治療的有效經(jīng)驗(yàn)。

現(xiàn)代研究表明，心肌梗死后心律失常、心室重構(gòu)發(fā)生等造成一系列損傷。有研究證實(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的過分降解在心室重構(gòu)中發(fā)揮一定作用，其中MMP在ECM降解中起重要作用，新近研究表明MMP/TIMP之間的平衡在維持組織結(jié)構(gòu)的完整和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用［4］。MMP-2是MMP家族中的重要成員，主要在心室合成，是一組能特異降解ECM的蛋白水解酶［5］。TIMP是MMP的組織抑制因子，參與調(diào)解組織局部MMP的活性［5］。Cx43是心肌和心室肌細(xì)胞的主要連接蛋白，也是細(xì)胞內(nèi)的主要電流傳導(dǎo)體，如果功能異常易引起心律失常和心肌沖動(dòng)傳導(dǎo)異常，其表達(dá)量與缺血性心臟病發(fā)展進(jìn)程有關(guān)系［6］。

本研究采用電針療法，在針刺腧穴的基礎(chǔ)上，加以脈沖電的治療作用，更能正確地掌握刺激參數(shù)，以期對AMI有更好的療效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支后，大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖上出現(xiàn)ST段上抬，T波抬高，而連續(xù)電針5 d后急性心肌梗死大鼠心電圖得到改善，ST段下移，心律恢復(fù)。模型組梗死心肌周圍Cx43表達(dá)下降，但是針刺組Cx43有明顯升高，說明針刺可以保護(hù)心肌組織的損傷，調(diào)節(jié)心律。電針組MMP-2表達(dá)升高，TIMP-2表達(dá)下降，說明電針可以通過調(diào)節(jié)MMP-2、TIMP-2的表達(dá)保護(hù)缺血梗死心肌組織，且有效對抗心律失常。

綜上所述，電針內(nèi)關(guān)、心俞穴可以調(diào)節(jié)心肌組織微環(huán)境相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)心律失常，保護(hù)缺血梗死心肌組織，防止心室重構(gòu)。

［1］World Health Organization.Guidelines for the treatment of malaria［M］.2ndEdition.Geneva：World Health Organization，2006.

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［3］鐘輝，李國彰.針刺治療心律失常的研究進(jìn)展［J］.中國醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2002，17（增刊）：42-46

［4］Ahmed S H，Clark L L，Pennington W R，et al.Matrix metalloproteinases/tissue inhibitors of metalloproteinases：relationship between changes in proteolytic determinants of matrix composition and structural，functional，and clinical manifestations of hypertensive heart disease［J］.Digest of World Core Medical Journals（Cardiology），2006，113（17）：2089-2096.

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