賈蔓箐，唐輝，*，李翠華，王國軍，趙紅濤

（1.新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子 832000；2.石河子大學(xué)化工學(xué)院，新疆石河子 832000）

棉油皂腳中植物甾醇的提取工藝研究

賈蔓箐1，唐輝1，*，李翠華2，王國軍1，趙紅濤1

（1.新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子 832000；2.石河子大學(xué)化工學(xué)院，新疆石河子 832000）

摘 要：為了探索從棉油皂腳中提取植物甾醇的工藝條件。以皂腳為原料，通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化最佳工藝條件，并對粗品進(jìn)行純化，以高效液相色譜法測定的甾醇含量為考察指標(biāo)。植物甾醇提取的最佳工藝為：皂化料液比1∶3，90℃下皂化3 h，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，料液比為1∶20，粗甾醇的提取率為75.6%，其中提取得到的β-谷甾醇和菜油甾醇的純度分別為（66.5±0.47）%、（5.67±0.08）%，其經(jīng)無水乙醇重結(jié)晶兩次后，純度可達(dá)91.8%。結(jié)果表明最佳提取工藝重現(xiàn)性較好；HPLC法測定甾醇含量結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

關(guān)鍵詞：棉油皂腳；植物甾醇；HPLC；提取

棉油皂腳是棉籽油生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的下腳料，在堿煉脫酸過程中采用氫氧化鈉溶液將毛油中的游離脂肪酸中和為鈉鹽，主要成分為高級脂肪酸（脂肪酸鈉鹽）[1]，并且同時(shí)含有棉酚[2]、甾醇、磷脂等高附加成分。我國每年可排放植物油皂腳數(shù)百萬噸，尋找新的處理方法并提取出有效成分，不僅保護(hù)環(huán)境，還具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

植物甾醇是一類以環(huán)戊烷全氫菲（即甾核）為骨架的類似環(huán)狀醇結(jié)構(gòu)的化合物，具有顯著的降膽固醇功效，還具有免疫調(diào)節(jié)，消炎退熱，防治心臟病等許多重要的生理功能[3-4]，近年來，甾醇在醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域被高度重視與關(guān)注[5]。在大多數(shù)已報(bào)道的研究中，一般都以脫臭餾出物作為提取原料，用不同的方法加以提取[6-10]。本實(shí)驗(yàn)以棉籽油皂腳為原料提取植物甾醇，建立HPLC法準(zhǔn)確定量，探索了一條合理工藝提取皂腳中的植物甾醇，以促進(jìn)資源的合理利用。

1 材料與方法

1.1 材料

棉油皂腳（新疆康隆油脂公司，批號1：111203，批號2：120221）；β-谷甾醇對照品（上海源葉生物制品有限公司，批號：20120214）菜油甾醇對照品（日本和光Wako，批號：2301）

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

日本島津LC-15C高效液相色譜儀（包括在線脫氣機(jī)、紫外檢測器、LC solution工作站等）；德國Staotious BP211D電子分析天平；AR1140萬分之一電子分析天平：奧豪斯國際貿(mào)易有限公司；DKZW—C型電子恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；TP 300超聲波清洗器：天鵬電子新技術(shù)有限公司；德國EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；A-1000S水流抽氣機(jī)：made by EYELA；CCA-20低溫冷卻水循環(huán)泵；

1.2.2 試劑

甲醇色譜純（Fisher Science），重蒸水；所用其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 甾醇的提取工藝

取棉油皂腳100 g于圓底燒瓶內(nèi)，加入適量1 mol/L的氫氧化鉀-乙醇溶液，高溫回流，減壓蒸餾回收乙醇。加入蒸餾水稀釋，將得到的皂化液冷卻，有機(jī)溶劑萃取2次，水洗至中性，在常溫下減壓蒸餾回收有機(jī)溶劑，得到粗甾醇制品。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

選擇影響甾醇提取率的幾個(gè)因素：即皂化料液比（皂腳質(zhì)量與1 mol/L氫氧化鉀-乙醇溶液的體積比）、皂化時(shí)間、萃取劑的選擇、萃取料液比（皂腳質(zhì)量與有機(jī)溶劑的體積比）分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，采用HPLC法在210 nm處進(jìn)行植物甾醇的含量考察各因素對甾醇提取率的影響。

2.3 正交試驗(yàn)

為了全面考察影響因素，設(shè)計(jì)并進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，確定提取棉油皂腳中植物甾醇的最佳提取參數(shù)。設(shè)定因素水平表如表1。

表1 正交設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Table of factors and levels of orthogonal design

2.4 粗甾醇的精制

稱取一定量的粗植物甾醇，加入60℃無水乙醇充分溶解，降溫至-5℃結(jié)晶18 h～24 h。在低溫條件下迅速抽濾，并用無水乙醇沖洗濾渣表面，濾渣在真空烘箱中50℃下干燥。干燥后的濾渣重復(fù)上述重結(jié)晶步驟，即可得到精制甾醇。

2.5 植物甾醇的測定

2.5.1 色譜條件

色譜柱：WondaSil Analysis C18 Column（4.6 mm×150mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇∶水=95∶ 5；流速 0.8mL/min；檢測波210 nm；進(jìn)樣量20 μL；柱溫25℃。植物甾醇在此條件下有較好的分離，色譜圖如圖1所示。

圖1 甾醇對照品及粗品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of reference and sample

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用高效液相色譜法測定。β-谷甾醇：Y=3 543.3X+25 769（R=0.999 9）；菜油甾醇：Y=3 573.6X+29 579（R=0.999 8）。在 40.16 μg/mL～240.96 μg/mL 和30.02 μg/mL～181.2 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，精密度分別為0.70%、0.49%。

2.5.3 供試品測定

分別取 3批原料（批號：111203），按“2.1”項(xiàng)下方法制備粗品甾醇，無水乙醇溶解，用微孔（0.45 μm）濾過按上述色譜條件進(jìn)行測定。重復(fù)進(jìn)樣3次，取平均值，根據(jù)回歸方程計(jì)算粗品中甾醇的純度及提取率。

3 結(jié)果與分析

3.1 提取條件單因素的考察

3.1.1 皂化料液比對甾醇提取率的影響

按2.1工藝提取植物甾醇，在反應(yīng)溫度90℃，反應(yīng)時(shí)間3 h的條件下對皂腳進(jìn)行再次皂化，考察料液比（皂腳質(zhì)量與1 mol/L氫氧化鉀－乙醇溶液的體積比）對皂化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 皂化料液比對提取率的影響Fig.2 The effect of solid-liquid on extraction

由圖2可知，當(dāng)料液比小于1∶3時(shí)，隨著堿液量的增加，甾醇提取率也隨之增加，這是因?yàn)樵砘哪康氖浅ブ舅岷头纸忡薮减?，皂化越趨完全，甾醇越易被提取，堿液量過少，皂化不完全，甾醇純度低且提取率低；當(dāng)料液比大于1∶3時(shí)，隨著堿液量過多，會(huì)造成試劑浪費(fèi)并且引入雜質(zhì)，甾醇提取率反而略下降。所以選取料液比為1∶3。

3.1.2 皂化時(shí)間對甾醇提取率的影響

按2.1工藝提取植物甾醇，在皂化料液比1∶3，反應(yīng)溫度90℃的條件下對皂腳進(jìn)行皂化，考察皂化時(shí)間對皂化反應(yīng)的影響，見圖3。

圖3 皂化時(shí)間對提取率的影響Fig.3 The effect of different time on extraction

由圖3可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間小于3 h時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，甾醇提取率隨之增加，因?yàn)樵谠砘磻?yīng)中物質(zhì)的傳遞和反應(yīng)需要一定時(shí)間，但是時(shí)間過長可能由于甾醇氧化或引入雜質(zhì)導(dǎo)致結(jié)果有所降低，從生產(chǎn)考慮，皂化反應(yīng)達(dá)到3 h時(shí)即可。

3.1.3 最優(yōu)萃取溶劑的選擇

按2.1工藝提取植物甾醇，在皂化料液比1∶3，反應(yīng)溫度90℃回流3 h的條件下對皂腳進(jìn)行皂化，分別選用乙酸乙酯、丙酮、氯仿、異丙醇、石油醚、乙醚進(jìn)行萃取，考察最優(yōu)萃取溶劑見圖4。

圖4 不同有機(jī)試劑對提取率的影響Fig.4 The effect of different solvent on extraction

從圖4看出不皂化物中萃取植物甾醇效果：乙酸乙酯＞石油醚＞乙醚，并且乙酸乙酯毒性低，不溶于水，更加利于實(shí)際操作，故萃取溶劑選乙酸乙酯。

3.1.4 萃取料液比對甾醇提取率的影響

按2.1工藝提取植物甾醇，在皂化料液比1∶3，反應(yīng)溫度90℃回流3 h的條件下對皂腳進(jìn)行皂化，選用不同體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，考察萃取料液比對甾醇提取率的影響見圖5。

圖5 萃取料液比對提取率的影響Fig.5 The effect of solid-liquid on extraction

隨著萃取劑用量增加，甾醇提取率也增大。這是因?yàn)檩腿┯昧吭蕉啵芙庠谳腿┲械溺薮荚蕉?，但在萃取料液?∶20以后，甾醇提取率提升并不顯著，這是由于甾醇已基本溶于萃取劑中了，再增加萃取劑用量對甾醇的結(jié)果影響不大。由圖可知，萃取料液比為1∶20即可。

3.2 正交試驗(yàn)

以料液比、反應(yīng)時(shí)間和萃取劑用量設(shè)定的L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果如表2。

由直觀分析和方差分析表可知，影響棉油皂腳中甾醇提取的主次因素依次為A（皂化料液比）＞B（皂化時(shí)間）＞C（萃取料液比），由表中可知，最優(yōu)工藝為A2B2C3，綜合考慮輔料成本與效益，后續(xù)操作等因素，得出最佳工藝條件為A2B2C2，即100 g原料，采用皂化料液比1∶3高溫回流3 h，乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取料液比為 1∶20 g/mL。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental results of orthogonal test

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

3.3 工藝驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照上述確定的最佳條件，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，棉油皂腳中植物甾醇提取率為75.6%，說明正交試驗(yàn)篩選所得的工藝穩(wěn)定可行。

3.4 粗品甾醇的精制結(jié)果

對粗品甾醇進(jìn)行重結(jié)晶精制，二次精制后純度可達(dá)91.8%，其中含有β-谷甾醇85.4%，菜油甾醇6.4%。

4 結(jié)論

1）選用HPLC法測定甾醇含量，此法快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性高，可用于測定棉油皂腳中甾醇含量及提取物純度的測定。

2）通過單因素和正交試驗(yàn)，得到自棉油皂腳中提取甾醇的最優(yōu)條件：皂化料液比1∶3，高溫下回流皂化3 h，萃取料液比1∶20進(jìn)行萃取，在此條件下，粗品植物甾醇的平均提取率為75.6%，β-谷甾醇和菜油甾醇的純度分別為（66.5±0.47）%、（5.67±0.08）%，對粗品甾醇進(jìn)行重結(jié)晶，二次精制后純度達(dá)91.8%。

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Study on Extraction Process of Phytosterols in Cottonseed Soapstock

JIA Man-qing1，TANG Hui1，*，LI Cui-hua2，WANG Guo-jun1，ZHAO Hong-tao1
（1.Key Laboratory of Xinjiang Phytomedicine Resources，College of Pharmacy of Shihezi University，Shihezi 832000，Xinjiang，China；2.College of Chemistry of Shihezi University，Shihezi 832000，Xinjiang，China）

Abstract：The process of extracting phytosterols from Cottonseed Soapstock has been established.Methods：The conditions have been optimized through single factor and orthogonal experiments.The crude extract was purified and the content of phytosterols was determined by HPLC.Results：Optimum extraction conditions were as follows：the Liquid-material ratio is 1∶ 3；saponification time is 3 h at 90℃；the extraction was carried out with ethyl acetate and the liquid-material ratio is 1∶ 20；the yield of the crude phytosterols is 75.6%and the purity of β-sitosterol and campesterol is （66.5±0.47） %and （5.67±0.08） %， respectively.The purity of total phytosterols has been enhanced from 70%to 91.8%after recrystallization with anhydrous ethanol twice.Conclusion：The optimized extraction process indicates satisfied repeatability and the method for determining phytosterols by HPLC is accurate and reliable.

Key words：cottonseed soapstock；phytosterols；HPLC；extraction

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.06.012

新疆建設(shè)兵團(tuán)博士基金項(xiàng)目（2009JC14）；石河子大學(xué)重大科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（gxjs2010-zdgg04）

賈蔓箐（1988—），女（漢），碩士，研究方向：天然藥物分析。

2013-01-29