李學(xué)平　劉萍

摘要： 采用平板法進(jìn)行菌種初篩和生物學(xué)特性研究，經(jīng)篩選純化得到1株高效解磷菌F1312，對該菌株的生物學(xué)特性在碳源、氮源、溫度、pH值等方面進(jìn)行了初步研究，并采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對發(fā)酵條件進(jìn)行了初步探討。結(jié)果表明：經(jīng)篩選所得的菌株F1312初步判斷為放線菌；對F1312進(jìn)行生物學(xué)測定，該菌株在所供4種碳源、氮源、pH值、溫度條件下均能生長，其最適碳源為麥芽糖，最適氮源為酵母浸膏粉，最適pH值為7，最適溫度為30 ℃；在發(fā)酵條件的優(yōu)化組合試驗(yàn)中，F(xiàn)1312的最適解磷條件為：pH值=7，溫度30 ℃，碳氮比20 ∶ 1，轉(zhuǎn)速150 r/min。

關(guān)鍵詞： 高效解磷菌；生物學(xué)；解磷效果；正交試驗(yàn)；放線菌

中圖分類號： S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0363-03

在土壤性質(zhì)、作物類型、磷肥種類和用量等一系列因素的影響下，每年施入的磷大約有75%～90%積累在土壤中成為難溶形態(tài)的磷 [1]，當(dāng)季利用率一般僅為10%～25% [2]。因此，如何提高磷肥利用率一直備受研究人員關(guān)注。

大量研究表明，土壤中的許多微生物都能夠?qū)⒅参镫y以吸收利用的無效磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用的有效磷形態(tài) [3-5]，這種微生物叫解磷菌。土壤中解磷菌能夠增加磷酸鈣的溶解性，提高土壤中的可溶性磷含量，從而提高植物對磷的利用效率，改善植物營養(yǎng)條件 [6]。對不同種類解磷微生物溶磷效果的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌、酵母、霉菌接種在不同磷源上時(shí)，表現(xiàn)出的溶磷能力不同 [7-11]。因此，研究解磷菌的解磷特性以及生物學(xué)特性，對促進(jìn)植物生長發(fā)育以及解磷真菌在農(nóng)學(xué)上的應(yīng)用起著重要作用。本研究采集草坪根際土壤，對解磷菌進(jìn)行篩選并進(jìn)行生物學(xué)特性研究，并對發(fā)酵液條件優(yōu)化組合進(jìn)行研究，以探討解磷菌的最適生長環(huán)境以及解磷的最適合條件。

1 材料與方法

1 1 供試樣品

采集內(nèi)陸鹽堿地草坪根際土壤，采用抖土法將收集的土樣放入密封袋內(nèi)立刻帶回實(shí)驗(yàn)室冷藏，備用。

1 2 培養(yǎng)基配方

1 2 1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 本試驗(yàn)中菌種初篩用的是有機(jī)磷固體培養(yǎng)基和無機(jī)磷固體培養(yǎng)基，配方如下：（1）有機(jī)磷固體培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0 5 g，NaCl 0 3 g，KCl 0 3 g，MgSO4·7H2O 0003 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0 03 g，MnSO4·4H2O 0 01 g，CaCO3 5 g，卵磷脂 0 2 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值7 0～7 5。（2）無機(jī)磷固體培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0 5 g，NaCl 0 3 g，KCl 0 3 g，MgSO4·7H2O 0003 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0 03 g，MnSO4·4H2O 0 01 g，Ca3（PO4）2 5 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值7 0～7 5。

1 2 2 保存培養(yǎng)基 菌種保存時(shí)用到的培養(yǎng)基為斜面培養(yǎng)基，其配方為：葡萄糖 15 g，NaNO3 1 g，K2HPO4 0 5 g，KCl 025 g，MgSO4·7H2O 0 25 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0 005 g，瓊脂 8 g，蒸餾水500 mL，自然pH值。

1 2 3 復(fù)篩培養(yǎng)基 菌種復(fù)培（純化）時(shí)用的培養(yǎng)基為有機(jī)磷液體培養(yǎng)基和無機(jī)磷液體培養(yǎng)基，配方為：

（1）有機(jī)磷液體培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0 5 g，NaCl 0 3 g，KCl 0 3 g，MgSO4·7H2O 0 003 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0 03 g，MnSO4·4H2O 0 01 g，CaCO3 5 g，卵磷脂 0 2 g，蒸餾水 1 000 ml，pH值7 0～7 5。

（2）無機(jī)磷液體培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0 5 g，NaCl 0 3 g，KCl 0 3 g，MgSO4·7H2O 0003 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0 03 g，MnSO4·4H2O 0 01 g，Ca3（PO4）2 5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值7 0～7 5。

1 2 4 活化培養(yǎng)基 經(jīng)過觀察，知道純化所得的菌種為放線菌類，所以活化時(shí)用到的培養(yǎng)基為高氏培養(yǎng)基，其配方為：葡萄糖 20 g，KNO3 1 g，K2HPO4 0 5 g，MgSO4·7H2O 0 5 g，NaCl 0 5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0 01 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值7 4～7 6。

1 2 5 發(fā)酵培養(yǎng)基 發(fā)酵條件優(yōu)化組合采用的培養(yǎng)基為無機(jī)培養(yǎng)基和有機(jī)培養(yǎng)基，配方為：

（1）有機(jī)培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4[KG 3]0 5 g，NaCl 0 3 g，KCl 0 3 g，MgSO4·7H2O 0 003 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0 03 g，MnSO4·4H2O 0 01 g，CaCO3 5 g，卵磷脂 0 2 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值 7 0～7 5。

（2）無機(jī)培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0 5 g，NaCl 0 3 g，KCl 0 3 g，MgSO4·7H2O 0 003 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0 03 g，MnSO4·4H2O 0 01 g，Ca3（PO4）2 5 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值7 0～7 5。

以上培養(yǎng)基制作完成之后均須在高壓滅菌鍋中，于 121 ℃、0 103 MPa條件下滅菌20 min。

1 2 6 發(fā)酵條件優(yōu)化組合 本試驗(yàn)中發(fā)酵條件優(yōu)化組合采用的是4因素（溫度、pH值、碳氮比、轉(zhuǎn)速）3水平的正交試驗(yàn)（表1）。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，綜合分析確定菌株生長的最適條件。endprint

1 3 菌株篩選

1 3 1 初篩 按照培養(yǎng)基配方與配量分別稱取各藥品，取少于總量的水于燒杯中，將各培養(yǎng)基成分（瓊脂除外）逐一加入水中待溶；將燒杯放在石棉網(wǎng)上文火加熱，并不斷攪拌，使各藥品快速溶解，然后補(bǔ)充水分至所需配培養(yǎng)基的量；用 1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7 0～7 5；將配置好的培養(yǎng)基分裝在錐形瓶內(nèi)，加上棉塞包裝滅菌。高壓滅菌后倒平板，次日，將采集的土壤過篩磨細(xì)，稱取10 g樣品，進(jìn)行梯度稀釋至10 -7、10 -8、10 -9，分別滴加菌液于相應(yīng)編號的平板表面，每個(gè)梯度做3個(gè)重復(fù)，用涂布器涂布均勻，20～30 min后倒置，并放于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。每天觀察平板，記錄菌落出現(xiàn)的日期、菌落解磷能力出現(xiàn)日期、菌落直徑、解磷圈出現(xiàn)日期及直徑大小。培養(yǎng)7 d后，得到解磷能力比較強(qiáng)的菌株進(jìn)行純化培養(yǎng)，將純化培養(yǎng)幾代的菌株進(jìn)行菌種保存。

1 3 2 復(fù)篩 采用液體發(fā)酵培養(yǎng)法，將解磷微生物培養(yǎng)在難溶性磷液體培養(yǎng)基上，按照配方配制液體培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌，在超凈工作臺上，按照無菌接種法，接種純化后的解磷真菌于發(fā)酵液，置于搖床中，30 ℃、120 r/min培養(yǎng) 7 d，每天觀察發(fā)酵液的變化，并記錄菌絲球的出現(xiàn)日期、菌絲球顏色，目測其大小。發(fā)酵結(jié)束后，進(jìn)行發(fā)酵液有效磷測定。

1 3 3 生物學(xué)測定 本次試驗(yàn)采用察氏培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，其配方如下：碳源30 g，NaNO3 2 g，K2HPO4 1 g，KCl 0 5 g，MgSO4·7H2O 0 5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0 01 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 ml，自然pH值。

2 結(jié)果與分析

2 1 菌種篩選

將菌懸液通過涂布平板法進(jìn)行培養(yǎng)后得到了20株解磷效果較好的解磷菌株。通過對菌種初篩時(shí)得到的20株菌株的培養(yǎng)及解磷能力的測定，得到了1株高效解磷菌F1312。高效解磷菌F1312解磷能力達(dá)318 26 mg/L。

2 2 菌種形態(tài)觀察及分類地位初步確定

培養(yǎng)皿中的菌株呈放射狀，生長初期為白色，穩(wěn)定后為青色。液體培養(yǎng)為白色菌絲球，球狀，直徑3～5 mm，發(fā)酵液為乳白色，黏稠，拉絲。由顯微鏡觀察后，發(fā)現(xiàn)其菌絲直徑為 1 μm，孢子呈橢圓形，直徑為1～1 2 μm，長為2～2 3 μm。初步確定為放線菌。

2 3 菌株解磷生物學(xué)特性研究

2 3 1 不同碳源對菌株生長的影響 碳源明顯影響菌株F1312的生長（圖1）。當(dāng)以麥芽糖為唯一碳源時(shí)，其生長情況最好，一直呈快速生長狀態(tài)。其次為葡萄糖，前3 d呈現(xiàn)出快速生長的趨勢，之后趨于平緩，且前5 d內(nèi)其菌落直徑大于麥芽糖。當(dāng)以蔗糖為唯一碳源時(shí)，前4 d呈顯出快速生長的趨勢，之后幾天趨于平緩。以乳糖為唯一碳源時(shí)，前5 d雖然也表現(xiàn)出較快的生長趨勢，但相對于其他3種碳源，其生長一直緩慢，菌落直徑最小。培養(yǎng)7 d時(shí)，當(dāng)碳源為麥芽糖時(shí)菌落直徑最大，達(dá)到38 0 mm，菌種長勢相對最好，葡萄糖和蔗糖相近，分別為35 0 mm和34 0 mm，乳糖相對生長最差，為31 0 mm。

2 3 2 不同氮源對菌落生長的影響 不同氮源明顯影響菌株F1312的生長（圖2）。當(dāng)以酵母浸膏粉為唯一氮源時(shí)，其生長最為迅速。其次為硝酸鉀，然后是硝酸鈉，最差的為亞硝酸鈉。前4 d酵母浸膏粉培養(yǎng)基上的F1312菌株和硝酸鉀培養(yǎng)基上F1312菌株生長情況大體相同，之后3 d酵母浸膏粉上的F1312菌株生長迅速。培養(yǎng)7 d時(shí)，以酵母浸膏粉為唯一碳源的培養(yǎng)基上的菌株菌落直徑最大，達(dá)到了 48 0 mm。以硝酸鉀為唯一氮源時(shí)，菌落直徑次之，為 45 0 mm。當(dāng)以硝酸鈉為唯一氮源時(shí)菌落直徑再次之，為36 mm。當(dāng)以亞硝酸鈉為唯一氮源時(shí)菌落直徑最小，菌株相對生長最差，其菌落直徑僅為2 7 mm。

2 3 3 不同溫度對菌落生長的影響 溫度對解磷菌的生長影響較大（圖3）。在不同溫度下，菌株F1312一直呈現(xiàn)出快速[CM（25]增長的趨勢。當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)菌落直徑最大，達(dá)到45 0 mm。當(dāng)溫度為20 ℃時(shí)菌落直徑最小，為36 0 mm。25 ℃ 和 35 ℃ 菌落直徑相近，分別為38 0 mm和43 0 mm。

2 3 4 不同pH值對菌落生長的影響 pH值對菌株F1312生長的影響并不是很大（圖4）。培養(yǎng)7 d時(shí)，菌落直徑最大的是pH值=7的培養(yǎng)基上的菌落，其直徑為48 0 mm；菌落直徑最小的是pH值=9的培養(yǎng)基上的菌落，其穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)的菌落直徑為42 0 mm。pH值=6的培養(yǎng)基為第二，其菌落直徑為460 mm。pH值=8的培養(yǎng)基為第三，其菌落直徑為44 0 cm。這說明菌株F1312生長環(huán)境偏酸性。當(dāng)pH值在 6～7 之間時(shí)，菌落直徑的趨勢是隨著其增大而增大，當(dāng)pH值在7～9之間時(shí)，菌落直徑隨著其增大而減小。所以當(dāng)pH值超過7時(shí)，pH值對該菌種的生長具有明顯的抑制作用。

2 4 解磷菌株F1312發(fā)酵條件優(yōu)化

菌株F1312不同試驗(yàn)組發(fā)酵液有效磷含量差異較大（表2），通過不同發(fā)酵條件組合發(fā)現(xiàn)，該菌株發(fā)酵的最適條件為：溫度30 ℃，pH值=7，碳氮比20 ∶ 1，轉(zhuǎn)速150 r/min，此條件下該菌株解磷能力最強(qiáng)。

3 結(jié)論

（1）高 效解磷菌F1312為放線菌，其解磷量為318 26 mg/L。

（2）F1312生長的最適pH值=7，最適溫度為30 ℃，最適碳源為麥芽糖，不同碳源中其長勢順序是：麥芽糖>葡萄糖>蔗糖>乳糖；最適氮源為酵母浸膏粉，不同氮源中長勢順序是：酵母浸膏粉>硝酸鉀>硝酸鈉>亞硝酸鈉。（3）該菌株最適發(fā)酵條件為：pH值=7，溫度30 ℃，碳氮比20 ∶ 1，轉(zhuǎn)速 150 r/min。

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