孫娜, 侯鑫, 萬(wàn)紅芳, 劉胥, 梁芳

(1.盤錦光合蟹業(yè)有限公司，遼寧省中華絨螯蟹育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 遼寧省，盤錦市 124200； 2.大連海洋大學(xué) 遼寧省，大連市)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)，又稱河蟹，是中國(guó)的傳統(tǒng)經(jīng)濟(jì)蟹類，每年的繁殖期將洄游至海水區(qū)或者是河口半咸水域進(jìn)行繁殖。其幼體發(fā)育可分為溞狀幼體(Ⅰ～Ⅴ期)和大眼幼體兩個(gè)階段[1]，這兩個(gè)階段是河蟹育苗中的兩個(gè)關(guān)鍵幼體時(shí)期。特別是溞狀幼體時(shí)期對(duì)外界環(huán)境的抵抗能力較弱，易受水中有毒物質(zhì)的影響，造成生長(zhǎng)發(fā)育不良甚至死亡。2014年Julie等[2]研究了石油水溶性成分對(duì)泥蟹(Rhithropanopeusharrisii)幼體的急性毒性實(shí)驗(yàn)，表明石油水溶性成分對(duì)其有明顯的毒性作用。因此，探究溞狀幼體時(shí)期對(duì)有毒物質(zhì)的耐受性對(duì)于河蟹育苗具有重要的意義。

盤錦地處遼河平原南部的遼河三角洲核心地帶，是中國(guó)北方河蟹的主產(chǎn)區(qū)，同時(shí)盤錦地區(qū)地下也蘊(yùn)藏著豐富的油氣資源[3]。隨著油氣資源的滾動(dòng)開發(fā)和石油化工企業(yè)的迅猛發(fā)展，石油烴類污染物在石油勘探、開采、煉制和加工運(yùn)輸過(guò)程中以含油廢水、落地原油和含油廢棄泥漿等形式進(jìn)入水體、土壤中，目前該區(qū)域水環(huán)境已經(jīng)受到不同程度的石油污染[4]。溶解分散在水體的石油烴是石油類污染物對(duì)水生生物產(chǎn)生直接毒性的成分，主要包括多環(huán)芳香烴、直鏈和支鏈烷烴、環(huán)烷烴與不飽和烴[5]。尤其是其中的多環(huán)芳香烴，不易降解，在水體和生物體內(nèi)的殘留時(shí)間較長(zhǎng)[6]。多環(huán)芳烴對(duì)鋸緣青蟹(Scyllaserrata)、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)、普通濱蟹(Carcinusmaenas)等蟹類均有明顯的毒性效應(yīng)[7-9]。盤錦地區(qū)是中國(guó)北方中華絨螯蟹蟹苗的主產(chǎn)地，而且因?yàn)楸P錦石油的開發(fā)，已有部分地區(qū)的水體受到污染，所以擬通過(guò)本次研究為科學(xué)評(píng)價(jià)水溶性石油烴對(duì)中華絨螯蟹各期溞狀幼體的毒性提供依據(jù)，同時(shí)為河蟹養(yǎng)殖環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警監(jiān)測(cè)提供數(shù)據(jù)參考，對(duì)于合理規(guī)避河蟹養(yǎng)殖過(guò)程中影響河蟹健康生態(tài)養(yǎng)殖的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因子具有良好的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

中華絨螯蟹種蟹取自盤錦光合蟹業(yè)三角洲基地室外育苗池，在室內(nèi)暫養(yǎng)10 d至排幼，取發(fā)育變態(tài)、整齊和活力好的個(gè)體，經(jīng)顯微鏡鑒定，分別為Z1、Z2、Z3、Z4、Z5期幼體，用于毒性實(shí)驗(yàn)。

過(guò)濾海水:在光合蟹業(yè)三角洲基地室外幼體培育池中取水，經(jīng)過(guò)24 h沉淀，用200目篩絹網(wǎng)過(guò)濾后充氣備用。鹽度范圍為19～21，pH為8.6～8.7。

配置水溶性石油烴母液:將0#柴油(采購(gòu)自中國(guó)石油盤錦加油站)和過(guò)濾海水按體積比 1∶1混合，加入助溶劑無(wú)水乙醇和表面活性劑吐溫-80各1mL，用磁力加熱攪拌器連續(xù)攪拌10 h后，在分液漏斗中靜置4 h，分離的下層液體即為水溶性石油烴母液[5]。用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定母液濃度[10]后，置于冰箱(4 ℃)保存。

1.2 試驗(yàn)方法

采用靜水式急性毒性試驗(yàn)法。試驗(yàn)容器為500 mL的燒杯,試驗(yàn)總水體體積為400 mL，投放試驗(yàn)幼體10只。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果將石油烴分散液母液按等對(duì)數(shù)間距(以10為底數(shù))稀釋成4.56、6.53、9.33、13.36、19.00和27.36 mg/L 6個(gè)質(zhì)量濃度梯度，每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)平行組，另設(shè)一個(gè)空白對(duì)照組。每期幼體試驗(yàn)時(shí)間為48 h,每24 h更換一次試驗(yàn)液體。試驗(yàn)液體溫度變化范圍是20～23 ℃。在試驗(yàn)開始后第24小時(shí)和第48小時(shí)觀察死亡情況，并記錄幼體死亡數(shù)。幼體死亡以沉底發(fā)白、對(duì)刺激無(wú)反應(yīng)為準(zhǔn)。

本實(shí)驗(yàn)pH值測(cè)定采用三信PHB-1型便攜式pH計(jì)，溶解氧測(cè)定采用YSI-55A型便攜式溶氧儀。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程水溫控制在20～23 ℃范圍內(nèi)，pH為8.6～8.7，溶解氧含量為5.5 ～7.5 mg/L。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 校正死亡率

自然死亡校正采用Abbot[11]的公式，具體計(jì)算方法見式(1)。

P=(P′-C)/(1-C)

式(1)

式中，P為校正后的自然死亡率(%)，P′為試驗(yàn)組死亡率(%)，C為對(duì)照組死亡率(%)，其中各相應(yīng)數(shù)據(jù)均為3個(gè)平行組的算術(shù)平均數(shù)。

1.3.2 半致死濃度、安全濃度計(jì)算

利用SPSS 21(IBM，美國(guó))中Probit模塊(概率單位回歸)分析數(shù)據(jù)，得到死亡幾率與濃度對(duì)數(shù)的線性回歸方程，并利用卡方檢驗(yàn)確定線性回歸方程的擬合優(yōu)度，同時(shí)求出24h和48h的LC50及其95%的置信區(qū)間[12-13]。

安全濃度采用Turubell 氏公式計(jì)算[14]，見式(2)。

式(2)

其中SC為安全濃度，24 hLC50為24 h的半致死濃度，48 hLC50為48 h的半致死濃度。

2 結(jié)果分析

2.1 中華絨螯蟹溞狀幼體的中毒癥狀

中華絨螯蟹各期溞狀幼體對(duì)不同濃度的水溶性石油烴的中毒反應(yīng)相似。實(shí)驗(yàn)開始6 h內(nèi)，低濃度組(4.56和6.53 mg/L兩組)以及空白對(duì)照組的幼體活動(dòng)狀況無(wú)明顯差異，趨光性較強(qiáng)，大多在水體的中下層活動(dòng)，觸底后腹部收縮，彈跳有力。中濃度和較高濃度組(9.33、13.36和19.12 mg/L)，1小時(shí)后幼體活性與對(duì)照組相比，明顯下降，3小時(shí)后陸續(xù)出現(xiàn)死亡個(gè)體。然而27.36 mg/L 濃度組投入幼體后，幼體活動(dòng)異常，在水體下層打轉(zhuǎn)，不時(shí)撞向燒杯壁，突然失去平衡，頭部朝下撞到杯底。有的頭部貼著杯底，腹部伸展，間歇式抽搐；也有少許在杯底匍匐移動(dòng)，無(wú)力彈跳；試驗(yàn)進(jìn)行至15 h后幼體趨光性變差，體色發(fā)白的程度越來(lái)越明顯，直至完全發(fā)白而死亡。

2.2 水溶性石油烴對(duì)中華絨螯蟹各期溞狀幼體急性毒性

由試驗(yàn)中幼體的中毒癥狀及表1數(shù)據(jù)可看出，隨著水溶性石油烴濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，中華絨螯蟹的各期溞狀幼體的校正死亡率逐漸提高，水溶性石油烴的濃度和作用時(shí)間共同影響了中華絨螯蟹溞狀幼體的死亡率。

通過(guò)SPSS對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，由表2可知，各期幼體24 h的半致死濃度(LC50)順序依次為：Z1

2.3 毒性評(píng)估

參照《環(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》生物監(jiān)測(cè)(水環(huán)境部分)[15]，由表4可知LC50在1～100 mg/L為高毒。而本次研究中24 h和48 h毒性實(shí)驗(yàn)的LC50的值均在1～100 mg/L之間，所以0#柴油的水溶性石油烴對(duì)中華絨螯蟹溞狀幼體是高毒物質(zhì)，對(duì)其有嚴(yán)重的毒害作用，應(yīng)引起人們的高度關(guān)注。

表1 水溶性石油烴對(duì)中華絨螯蟹各期溞狀幼體的毒性Tab.1 The toxicity of water-soluble petroleum hydrocarbons to zoea (Z1～Z5) of Eriocheir sinensis n=3

表2 水溶性石油烴對(duì)中華絨螯蟹各期溞狀幼體的毒性特征的分析Tab.2 The toxicity characteristic analysis of water-soluble petroleum hydrocarbons to zoea (Z1～Z5) of Eriocheir sinensis

表3 水溶性石油烴濃度對(duì)數(shù)與中華絨螯蟹各期溞狀幼體死亡幾率的線性回歸關(guān)系Tab.3 The linear regression analysis of the concentration logarithm of water-soluble petroleum hydrocarbons to the mortality rate of zoea (Z1～Z5) of Eriocheir sinensis

注：線性回歸方程中，x為水溶性石油烴濃度對(duì)數(shù)值，y為中華絨螯蟹各期溞狀幼體死亡幾率; “***”表示P值在0.001水平上顯著相關(guān)。

表4 化學(xué)物質(zhì)對(duì)水生生物的毒性分級(jí)Tab.4 Toxicity grades of chemical substances to aquatic organisms mg·L-1

3 討論

海洋生物在幼體階段對(duì)石油類污染物均較為敏感，主要由于其神經(jīng)中樞和呼吸器官等重要部位接近體表，而表層皮膜一般較薄，有毒物質(zhì)容易入侵，并且幼體的運(yùn)動(dòng)能力相對(duì)成體較差，遇到污染環(huán)境，不能及時(shí)逃離。因此一旦出現(xiàn)石油類污染物泄漏事故，不僅會(huì)威脅海洋生物成體，對(duì)其幼體的毒害作用更甚[16]。本次研究中根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在石油烴質(zhì)量濃度4.56～27.36 mg/L的范圍內(nèi)進(jìn)行濃度的梯度設(shè)計(jì)，而實(shí)驗(yàn)選擇的鹽度19～21為中華絨鰲蟹溞狀幼體生長(zhǎng)發(fā)育最適的鹽度范圍。

本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中幼體出現(xiàn)的沉底、撞壁、活力減弱以及身體發(fā)白等中毒現(xiàn)象與沈和定等[17]的甲醛對(duì)中華絨螯蟹各期溞狀幼體及波海紅胞藻(RhodomonasbalticaKarsten, 1898)的急性毒性和盧偉等[18]的新潔爾滅對(duì)中華虎頭蟹(Orithyiasinica)幼體的急性毒性試驗(yàn)中的溞狀幼體中毒癥狀是相似的。由于石油烴的成分組成復(fù)雜，不同種類水生生物或同種水生生物的不同發(fā)育階段對(duì)同種石油烴的耐受性是不同的。0#柴油分散液對(duì)馬糞海膽(Hemicentrotuspulcherrimus)幼蟲24 h和48 h的半數(shù)效應(yīng)濃度為18.2和15.5 mg/L[19]，而對(duì)小球藻 (Chlorellavulgaris)的24 h和48 h半數(shù)效應(yīng)濃度為23.53和14.39 mg/L[20]，對(duì)菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)的24 h半致死濃度為52.6 mg/L[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，0#柴油水溶性石油烴對(duì)溞狀幼體的24 h和48 h半致死濃度均低于馬糞海膽幼蟲、小球藻以及菲律賓蛤仔，說(shuō)明中華絨螯蟹溞狀幼體對(duì)石油烴的耐受性低，相比于馬糞海膽幼蟲、小球藻以及菲律賓蛤仔，中華絨螯蟹溞狀幼體對(duì)石油烴的敏感性高。由表1中同一濃度組下不同階段幼體的的校正死亡率隨著幼體的發(fā)育呈下降趨勢(shì)；同一發(fā)育階段隨著濃度增加校正死亡率上升的規(guī)律，可證明各期溞狀幼體對(duì)0#柴油的水溶性石油烴的耐受性是不同的。

本次實(shí)驗(yàn)的局限性在于，沒有測(cè)定0#柴油中石油烴的化學(xué)成分以及石油烴對(duì)中華絨鰲蟹溞狀幼體抗氧化系統(tǒng)的影響。目前許多學(xué)者在對(duì)石油烴的毒性研究中發(fā)現(xiàn)為, 芳烴的含量是決定毒性大小的關(guān)鍵因素[22-23]。多環(huán)芳烴環(huán)氧化物被認(rèn)為是多環(huán)芳烴致癌及致突變的重要活性代謝產(chǎn)物，因其具有親電子特性，可以和生物大分子尤其是分子相互作用,形成多種類型的DNA損傷,如加合物、鏈斷裂以及堿基的非正?；瘜W(xué)修飾或缺失等[24-25]。石油污染物的毒性與其中含有的可溶性芳烴衍生物(如苯、萘、菲及它們的烷基衍生物)的含量呈正比關(guān)系[26]。此外，水生生物對(duì)石油烴等污染物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量自由基，主要是生物轉(zhuǎn)化酶引起的氧自由基含量增加和污染物中間代謝物的氧化還原循環(huán)，而過(guò)量的自由基可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生廣泛的氧化損傷[27]。張林寶等[28]的研究同樣表明，0#柴油水溶性成分對(duì)菲律賓蛤仔的抗氧化系統(tǒng)造成了損傷。因此，在研究石油烴對(duì)水生生物的毒性時(shí)，不僅要考慮石油烴的成分，還應(yīng)該考慮生物本身代謝的機(jī)理，今后的實(shí)驗(yàn)中將加深這方面的研究。