袁青,趙蓉,俞裕天,李星兒,陳飛,劉龍琳,曹勇,郎建英

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靳三針對宮內(nèi)窘迫HIBD大鼠大腦皮質(zhì)Cyt-c和Caspase-3表達的影響

袁青1,趙蓉2,俞裕天3,4,李星兒5,陳飛6,劉龍琳3,曹勇3,郎建英7

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)針灸康復(fù)臨床醫(yī)學(xué)院,廣州 510405;2.廣州市醫(yī)藥技術(shù)學(xué)校,廣州 510430;3.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣州 510405;4.佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院,佛山 528031;5.華南師范大學(xué)激光運動醫(yī)學(xué)實驗室,廣州 510006;6.廣州市十三行國醫(yī)館,廣州 510415;7.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,廣州 510405)

目的 探討靳三針對宮內(nèi)窘迫HIBD大鼠大腦皮質(zhì)Cyt-c和Caspase-3表達的影響,揭示靳三針對大腦的保護機制。方法 SD雌性大鼠妊娠21 d時剖腹,用止血鉗夾閉雙側(cè)子宮角血管5 min,剖宮產(chǎn)取出幼鼠經(jīng)行為學(xué)及腦組織切片確認缺氧缺血性腦損傷的為模型大鼠,隨機分為模型組、針刺組。模型組不針刺;針刺1組、針刺2組、針刺3組、針刺4組分別于出生后第3、5、7、14天開始針刺,連續(xù)7 d;正常對照組自然分娩,不造模不針刺。所有組別大鼠均于出生后21 d斷頭取腦組織,檢測大腦皮質(zhì)中Cyt-c和Caspase-3的表達。結(jié)果 4個針刺組的Cyt-c光密度值都有所下降,其中針刺1組、針刺2組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。針刺1組Caspase-3的表達被明顯下調(diào),與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。結(jié)論 出生后第3天開始針刺對宮內(nèi)窘迫HIBD大鼠腦的保護作用與Cyt-c和Caspase-3表達的下調(diào)有關(guān)。

針刺;靳三針;HIBD;Cyt-c;Caspase-3;大鼠

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是指由圍生期窒息引起的足月兒和近足月兒(胎齡≥34周)的缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD),特點是在出生第1天出現(xiàn),可伴驚厥樣動作、通氣不足或呼吸暫停,原始反射和腦干反射表現(xiàn)受抑制等表現(xiàn),其顯著病理變化是腦血流異常。HIE是導(dǎo)致新生兒死亡和不可逆性腦損傷的主要原因[1],重者可遺留腦性癱瘓、癲癇等難治性兒童腦病[2],輕者也可能是導(dǎo)致患者今后學(xué)習(xí)障礙、輕癱、細微運動問題、注意力缺陷及高反應(yīng)性的危險性升高的原因。因此,如何有效改善HIE所致的病理狀況一直是醫(yī)學(xué)界研究的重要內(nèi)容之一。在既往研究中,我們用5 min延遲剖宮產(chǎn)模擬胎兒宮內(nèi)窒息的病理進程,成功建立了HIBD新生大鼠模型[3],本研究采用免疫組化染色法觀察不同針刺介入時間對大腦皮質(zhì)Cyt-c和Caspase-3表達情況,以探討針刺治療HIBD的最佳介入時機。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

已明確預(yù)產(chǎn)期的妊娠SD雌性大鼠21只,體重210～290 g,來源于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物科技發(fā)展有限公司[SCXK(粵)2006-0015]。造模手術(shù)及針刺在廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心屏障動物實驗室[SYXK(粵) 2008-0001]進行。

1.2 主要試劑及儀器

Cyt-c試劑盒,Caspase-3試劑盒(SIGMA公司),二抗、SABC(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),顯微鏡(奧林巴斯,BX50),穗片牌美容針灸針(0.28 mm× 13 mm,100支/盒)、大龍移液器[10mL、200mL、1000mL,大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司]等。

1.3 造模方法

造模孕鼠接受經(jīng)Bjelke法改良的延遲剖宮產(chǎn)術(shù)[4]和巨容等用自制血管帶阻斷雌鼠子宮角血管造模法[5]改良而成,孕鼠妊娠21 d上午,不麻醉頸錯位法處死,仰臥位置于手術(shù)板上,沿腹中線剪開皮膚、肌肉,打開腹腔,暴露雙側(cè)子宮,用4個血管鉗分別夾閉雙側(cè)上下子宮角血管,立即計時開始,將事先浸泡于37℃生理鹽水中的無菌紗布覆蓋在子宮上,不斷更換紗布,保持局部溫度。到達5 min立即撕破子宮,擠出新生大鼠,撕掉胎盤,保留臍帶,用干棉球擦去口、鼻部羊水,置于37℃恒溫水浴箱中墊有干毛巾的搪瓷托盤上保暖。取出全部新生大鼠的時間不超過2 min。

通過對新生大鼠進行翻正、斜坡及懸吊等行為學(xué)測試及HE染色的腦組織切片中的神經(jīng)細胞死亡程度進行定位和定性分析,比較各組行為差異及同一時段的正常組、模型組新生大鼠腦組織HE染色中死亡的神經(jīng)細胞數(shù)量、范圍和出現(xiàn)部位,確認出現(xiàn)全腦皮層廣泛、典型的神經(jīng)細胞死亡為造模成功[3,6]。

1.4 針刺方法

實驗新生大鼠分正常組、模型組、針刺1組、針刺2組、針刺3組、針刺4組。代乳鼠自然分娩的幼鼠為正常組,不針刺;行延遲剖宮產(chǎn)后不針刺的幼鼠為模型組;延遲剖宮產(chǎn)后第3天開始行針刺操作的幼鼠為針刺1組;延遲剖宮產(chǎn)后第5天開始行針刺操作的幼鼠為針刺2組;延遲剖宮產(chǎn)后第7天開始行針刺操作的幼鼠為針刺3組;延遲剖宮產(chǎn)后第14天開始行針刺操作的幼鼠為針刺4組,4組針刺組均連續(xù)針刺7 d,針刺選取“靳三針療法”中的“腦三針”、“顳三針”、“智三針”[7],參照《實驗針灸學(xué)》[8],結(jié)合人與動物骨度類比,每個穴位模擬得氣后(大鼠有叫喚、掙扎等反應(yīng))行捻轉(zhuǎn)手法,持續(xù)、均勻捻轉(zhuǎn)20 s,捻轉(zhuǎn)幅度±180°,頻率120次/min,不留針。所有組別的SD大鼠均于出生后21 d處死。

1.5 標本采集

對到達預(yù)定觀察點的大鼠經(jīng)行為學(xué)評估后,將大鼠處死,斷頭取腦,冰盤操作,快速剝離顱骨后取出腦組織,生理鹽水沖洗后即可置入4%中性甲醛溶液固定,之后用全自動生物組織脫水機進行脫水、浸蠟、包埋、切片,待測。

1.6 指標檢測

采用免疫組織化學(xué)染色法,操作簡要如下。TO型生物制片透明劑充分脫蠟,梯度乙醇水化,3%H2O2避光孵育10 min;流水沖洗2 min,浸泡于檸檬酸鹽緩沖液中,高壓鍋加壓后1300 W(180℃)煮3 min;冷卻至室溫,PBS浸洗3 min×4次,山羊血清封閉20 min;不洗,分別滴加稀釋濃度為1:75的兔抗大鼠Cyt-c和Caspase-3抗體,4℃孵育過夜;PBS浸洗3 min×4次,滴加生物素化山羊抗兔IgG,37℃孵育20 min;PBS浸洗3 min×4次,滴加SABC復(fù)合物,37℃孵育20 min; PBS浸洗3 min×4次,滴加DAB顯色液,鏡下控制顯色約3～5 min,觀察顏色顯現(xiàn)淡橘色時,流水沖洗終止顯色;滴加蘇木素染液3 min,流水沖洗2 min,1%氨水浸洗數(shù)秒,流水中再沖洗2 min;脫水,中性樹膠封片,鏡檢。細胞核藍染,細胞漿或細胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著的細胞即是陽性細胞。陰性對照以0.01 mmol/L PBS代替一抗,其余免疫組化步驟同上。

1.7 圖像處理

每個腦組織在顯微鏡40倍物鏡下,定位于頂葉外側(cè)大腦皮質(zhì)椎體細胞層,左右對稱,各取3個連續(xù)視野,用廣州明美圖像處理軟件進行拍照,所得照片的統(tǒng)計場總面積均為1768185.44mm,用北京航空航天圖像處理軟件對照片自動進行陽性細胞光密度值計算,6張圖片所得數(shù)據(jù)求平均值,作為該腦組織大腦皮層觀察區(qū)的Cyt-c和Caspase-3陽性細胞光密度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示,采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理,多組計量資料的均數(shù)比較用單因素方差分析(-),多組間兩兩比較用法。所有統(tǒng)計結(jié)果均以＜0.05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦組織缺血灶中Cyt-c的表達

模型組Cyt-c光密度值明顯高于正常組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05),說明宮內(nèi)窘迫所造的HIBD大鼠Cyt-c的表達被明顯提高。4個針刺組的Cyt-c光密度值都有所下降,其中針刺1組、針刺2組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05),提示3 d開始針刺和5 d開始針刺能更好地降低Cyt-c表達。詳見表1、圖1。

表1 各組大鼠腦組織Cyt-c光密度值比較 (±s)

表1 各組大鼠腦組織Cyt-c光密度值比較 (±s)

組別nCyt-c光密度值 正常組80.328±0.125 模型組80.619±0.4201) 針刺1組80.431±0.4552) 針刺2組80.455±0.2042) 針刺3組80.592±0.202 針刺4組80.555±0.196

注:與正常組比較1)＜0.05;與模型組比較2)＜0.05

正常組模型組針刺1組 針刺2組針刺3組針刺4組

2.2 大鼠腦組織缺血灶中Caspase-3的表達

表2 各組大鼠腦組織Caspase-3光密度值比較 (±s)

表2 各組大鼠腦組織Caspase-3光密度值比較 (±s)

組別nCaspase-3光密度值 正常組80.290±0.182 模型組80.602±0.1481) 針刺1組80.312±0.1122) 針刺2組80.688±0.249 針刺3組80.534±0.294 針刺4組80.681±0.112

注:與正常組比較1)＜0.05;與模型組比較2)＜0.05

模型組Caspase-3光密度值明顯高于正常組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05),說明宮內(nèi)窘迫所造的HIBD大鼠腦組織Caspase-3的表達被明顯提高。僅有針刺1組Caspase-3的表達被明顯下調(diào),與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05),提示3 d開始針刺能明顯下調(diào)Caspase-3的表達。詳見表2、圖2。

正常組模型組針刺1組 針刺2組針刺3組針刺4組

3 討論

大鼠大腦皮質(zhì)經(jīng)過HIBD后神經(jīng)細胞的死亡有兩種形式,即壞死和凋亡。Caspase家族在HIBD中發(fā)揮著重要作用,其中Caspase-3是Caspase級聯(lián)“瀑布”下游最關(guān)鍵的凋亡蛋白酶,在各種因素啟動的凋亡程序中起最后的樞紐作用[9]。

Cyt-c的釋放是細胞凋亡的重要環(huán)節(jié)之一。在HIBD的條件下,線粒體處于能量缺乏狀態(tài),使其通透性轉(zhuǎn)運孔開放,釋放出Cyt-c等與凋亡相關(guān)的活性物質(zhì),直接啟動凋亡途徑。Cyt-c定位于線粒體內(nèi)膜上,是在呼吸鏈中電子傳遞必需的一類色素蛋白,其色素輔基是含鐵的卟啉衍生物。Cyt-c在激活Caspases,誘導(dǎo)細胞凋亡方面具有重要意義。一旦Cyt-c釋放,就將激活細胞凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1)介導(dǎo)的DEVD (ASP-Glu-Val-ASP序列)特異的Caspase蛋白水解酶(DEVD-Specific protease),引起快速凋亡一種源于電子傳遞被阻斷的緩慢壞死過程而使細胞死亡[10]。在此過程中,Cyt-c與Apaf-1及dATP結(jié)合,繼之激活Caspase-9,然后這作為依賴Cyt-c的Caspases級聯(lián)反應(yīng)的始動因子,再先后激活Caspase-3以及Caspase- 2、6、8、10等效應(yīng)Caspase, 最終導(dǎo)致細胞凋亡。

Marsden等人[11]的研究顯示線粒體不是凋亡引發(fā)器,而具有某種擴大Caspase級聯(lián)的作用。

本研究首次應(yīng)用宮內(nèi)窘迫HIBD大鼠進行試驗,宮內(nèi)窘迫HIBD大鼠較以往的HIBD大鼠模型更好地模擬了新生兒缺血缺氧(HIE)的整個生理病理狀況[3],本次實驗顯示,該模型腦組織神經(jīng)元中Cyt-c、Caspase-3的表達都明顯增加。

我們應(yīng)用靳三針療法對該模型進行干預(yù),實驗結(jié)果提示,各組Cyt-c的表達均有所下降,而Caspase-3的表達并無發(fā)現(xiàn)明顯規(guī)律;出生后第3天就開始針刺的HIBD大鼠(針刺1組),Cyt-c、Caspase-3的表達都得到明顯的下調(diào)。我們的同期研究也提示,各針刺組凋亡細胞均有所減少,而針刺1組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。因此,針刺1組的結(jié)果提示,在宮內(nèi)窘迫引起的HIBD發(fā)生后第3天起連續(xù)行靳三針療法,可以明顯抑制神經(jīng)細胞的凋亡[12],而針刺對神經(jīng)細胞凋亡的抑制作用很可能是通過下調(diào)Cyt-c、Caspase-3水平來實現(xiàn)的,該結(jié)果與以往的研究結(jié)論[13]相近。其余針刺組均無出現(xiàn)Cyt-c、Caspase-3水平的同時下調(diào),提示及早對HIBD進行針刺干預(yù)能明顯改善病情。

靳三針療法為主治療小兒腦病已有20余年,療效肯定,國家中醫(yī)藥管理局已將“靳三針治療兒童精神發(fā)育遲滯和兒童自閉癥臨床規(guī)范化研究”兩項成果作為臨床適宜療法向全國推廣[14-15]。目前對靳三針治療小兒腦病的臨床研究很多,對其作用機理的基礎(chǔ)研究較少。本實驗結(jié)果表明,出生后3 d即進行靳三針療法可以下調(diào)HIBD大鼠腦組織Cyt-c、Caspase-3的表達水平,并且初步提示,及早行靳三針療法可能通過抑制線粒體Cyt-c途徑的細胞凋亡而起到腦保護的作用。

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Effect of Jin’s Three-needle Scalp Electroacupuncture on Cyt-c and Caspase-3 Expressions in the Cerebral Cortex in Intrauterine Distress-induced HIBD Rats

1,2,-3,4,-5,6,-3,3,-7.

1.,510405,; 2.,510430,; 3.,510405,4.,528031,; 5.,510006,; 6.,510415,; 7.,510405,

Objective To investigate the effect of jin’s three-needle scalp electroacupuncture on Cyt-c and Caspase-3 expressions in the cerebral cortex in Intrauterine distress-induced HIBD rats and reveal the mechanism of its protective action on the brain. Method The abdomen was incised in a female SD rat at 21 days of pregnancy. Bilateral uterine horn blood vessels were tightly clamped with a hemostat for five minutes. An infant rat was then taken out by a cesarean section. A rat model of hypoxic-ischemic brain damage was confirmed by the use of a behavior test and brain tissue sections. The rats were randomized into model and acupuncture groups. The model group was not needled. Acupuncture groups 1, 2, 3 and 4 began to be needled at 3, 5, 7 and 14 days after birth, respectively. Acupuncture treatment was given for seven consecutive days. The normal control group was naturally delivered, not used to make a model and not needled. All groups of rats were decapitated to take the brain tissue at 21 days after birth. Cyt-c and Caspase-3 expressions in the cerebral cortex were detected. Result Cyt-c optical density value decreased somewhat in the four acupuncture groups; there was a statistically significant difference between acupuncture group 1 or 2 and the model group (＜0.05). Caspase-3 expression was significantly down-regulated in acupuncture group 1; there was a statistically significant difference compared with the model group (＜0.05). Conclusion The protective effect of acupuncture beginning at 3 days after birth on the brain is related to the down-regulation of Cyt-c and Caspase-3 expressions in intrauterine distress-induced HIBD rats.

Acupuncture; Jin’s three needles; HIBD; Cyt-c; Caspase-3; Rats

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2015.08.0794

2015-01-10

國家自然科學(xué)基金項目(81072878,81373713)

袁青(1961 - ),男,教授,碩士生導(dǎo)師

俞裕天(1987 - ),男,在站博士后,Email:195824064@qq.com