李玉山，陳河濤，楊夕陽，王全先，劉軍杰，王琳凱，蘇彥華，孫 琳

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院人類精子庫鄭州450052

(2015-01-24收稿 責(zé)任編輯 王 曼)

不孕不育是全球性的生殖健康難題，影響了全世界約15%的夫婦［1］。75%的不育患者原因不明，屬于特發(fā)性［2］。臨床研究［3］表明，超過80%的不育患者存在精子運動缺陷，其中19%為特發(fā)性弱精子癥。弱精子癥發(fā)病機(jī)制多種多樣，其中引起精子活力低下的常見原因有精液液化異常、精索靜脈曲張、自身免疫因素、吸煙、飲酒等。為進(jìn)一步闡明弱精子癥的發(fā)病機(jī)制，作者所在課題組前期進(jìn)行了一系列基因水平的相關(guān)研究。目前已有超過300個精子相關(guān)基因被證實與不孕不育發(fā)病有關(guān)，如精子鞭毛基因 sept4［4］、tcte3［5］和 catsper1［6］。Tektins(簡 稱TEKT)是一個富含coiled-coil結(jié)構(gòu)域的微管蛋白家族，結(jié)構(gòu)高度保守，目前包含TEKT1～5等5個家族成員，是精子鞭毛軸絲及其附屬結(jié)構(gòu)的重要組成部分［7］。TEKT3定位于精子線粒體膜表面和鞭毛中段外周致密纖維［8］。tekt3基因敲除小鼠精子前向運動能力顯著降低且精子尾部結(jié)構(gòu)缺陷增加，表明TEKT3的表達(dá)缺失可能引起精子運動能力降低，進(jìn)而導(dǎo)致弱精子癥的發(fā)生［9］。劉利敏［10］通過構(gòu)建mRNA差異表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)弱精子癥精子TEKT3 mRNA表達(dá)水平下調(diào)。然而目前尚缺少TEKT3在人類弱精子癥患者精子中表達(dá)的研究。該研究采用RTPCR和Western blot方法，檢測TEKT3 mRNA和蛋白在正常男性和特發(fā)性弱精子癥患者精子中的表達(dá)水平，探討特發(fā)性弱精子癥的發(fā)生機(jī)制，為深入了解特發(fā)性弱精子癥提供理論基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2014年6月至10月就診于鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖中心男科門診的35例弱精子癥患者(年齡23～39歲)和35份同期河南省人類精子庫健康體檢合格供精者(年齡20～40歲)的精液標(biāo)本。研究對象符合以下標(biāo)準(zhǔn):①無傳染病史。②無性功能障礙，無精索靜脈曲張、附睪炎。③無家族遺傳病史。④肝腎功能正常，內(nèi)分泌各項激素檢查正常。⑤排除少精子癥、無精子癥、畸形精子癥患者。該研究獲得鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象簽訂知情同意書。

1.2 精液檢測 受試者禁欲3～7 d，采用手淫方式收集精液于廣口干燥無菌取精杯中，精液經(jīng)37℃水浴30 min液化完全。嚴(yán)格按照第五版《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》進(jìn)行分析，排除精液量、液化時間、pH、酸性磷酸酶、精漿果糖、α葡萄糖苷酶、精子形態(tài)等參數(shù)異常的精液樣本。精液標(biāo)本涂片后自然干燥，95%乙醇和乙醚固定10 min，光學(xué)顯微鏡下選擇涂片上多個區(qū)域進(jìn)行精子形態(tài)評估，每片計數(shù)200個精子，計算正常形態(tài)精子百分率。計算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)(北京偉力新世紀(jì)科技發(fā)展有限公司)連續(xù)3次檢測結(jié)果顯示，正常對照組精子濃度均≥20×106mL－1，精子前向運動能力≥32%;弱精子癥組精子濃度均≥20×106mL－1，精子前向運動能力≤32%。

1.3 精子的分離 采用完全液化的精液標(biāo)本經(jīng)45%和90%Percoll分離液(美國Pharmacia公司)非連續(xù)密度梯度離心法分離精子。在15 mL離心管中加入體積比為1∶1的45%和90%Percoll分離液，隨后加入相同體積的精液標(biāo)本，600 g條件下離心20 min。收集底部部分精子，用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗滌 3次，將精子濃度調(diào)整為 50 ×106mL－1，－80℃保存。采用改良巴氏染色法觀察精子形態(tài)。

1.4 精子中TEKT3 mRNA的RT-PCR檢測 嚴(yán)格按照RNA提取試劑盒(北京康為世紀(jì)公司)操作說明書提取分離純化精子的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司)操作說明，每樣本取等量總RNA 10μL進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，取cDNA 3 μL作為模板，按照PCR試劑盒(TaKaRa公司)操作說明在25μL反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增。引物用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，由北京鼎國生物公司合成。TEKT3上游引物序列為5'-CTCAGGCAGACACAAC CCAA-3'，下 游 為 5'-GATCCGGTAAGCCGTCTGTT-3'，產(chǎn)物 389 bp;內(nèi)參上游引物序列為 5'-CGG GAAATCGTGCGTGAC-3'，下 游 為 5'-TGGAAGGTG GACAGCGAGG-3'，產(chǎn)物434 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，圖像掃描儀掃描，用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.5 精子中TEKT3蛋白的Western blot檢測取分離純化后的精子，37℃水浴解凍，加入一定量4℃預(yù)冷的0.01 mol/L PBS(pH 7.4)，4 ℃ 3 000 g 離心5 min，棄去上清，在離心管中加入100μL細(xì)胞裂解液RIPA和1μL蛋白酶抑制劑PMSF(北京索萊寶科技有限公司)，充分吹打，冰上裂解30 min，進(jìn)一步超聲裂解10 s×5次，低溫高速離心機(jī)4℃12 000 g離心10 min，吸取上清液(即精子總蛋白)，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海BestBio公司)檢測總蛋白濃度。取30μg等量總蛋白上樣，100 g/L SDS-PAGE凝膠電泳(80 V 30 min，120 V 120 min)，半干法(20 V 120 min)轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜，用含50 g/L脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，3次洗滌后與1∶600稀釋的一抗(鼠抗人TEKT3抗體，臺灣Abnova公司)37℃孵育1 h，TBST洗膜5次，10 min/次;再用1∶2 500稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(兔抗鼠IgG，北京鼎國生物公司)室溫孵育1 h，然后TBST洗滌3～5次，5 min/次。以β-actin為內(nèi)參。處理后的醋酸纖維素膜經(jīng)Odyssey Clx雙紅外熒光成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)掃描，用Image Studio軟件獲取圖像并進(jìn)行處理。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行分析。兩組精液基本參數(shù)、TEKT3 mRNA和蛋白表達(dá)水平的比較采用兩獨立樣本t檢驗，采用Pearson相關(guān)系數(shù)來描述TEKT3表達(dá)與前向運動精子率的相關(guān)性。檢驗水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組精液基本參數(shù)的比較 正常對照組與弱精子癥組年齡和精液量、pH值、精子濃度等參數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，但弱精子癥組前向運動精子率低于正常對照組。見表1。

表1 兩組精液基本參數(shù)的比較

2.2 正常對照組與弱精子癥組精子形態(tài)學(xué)比較見圖1。正常對照組正常形態(tài)精子百分率為(25.42±5.26)%;弱精子癥患者精子形態(tài)發(fā)生變化，精子尾部畸形、缺陷增加，其正常形態(tài)精子百分率為(7.21 ±2.45)%，低于正常對照組(t=18.528，P ＜0.001)。

圖1 正常對照組(A)與弱精子癥組(B)精子形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(×400)

2.3 正常對照組和弱精子癥組TEKT3 mRNA和蛋白表達(dá)的比較 與正常對照組比較，弱精子癥組TEKT3 mRNA和蛋白的表達(dá)均降低，見圖2、3和表2。

圖2 正常對照組和弱精子癥組TEKT3 mRNA的RT-PCR檢測M:Marker;A1、A2、A3:弱精子癥組;N1、N2:正常對照組。

圖3 正常對照組和弱精子癥組TEKT3蛋白的Western blot檢測A1、A2、A3:弱精子癥組;N1、N2、N3:正常對照組。

表2 兩組精子中TEKT3表達(dá)的比較

2.4 前向運動精子率與TEKT3 mRNA和蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析 經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，弱精子癥組前向運動精子率與精子TEKT3 mRNA表達(dá)水平(r=0.684，P=0.001)和 TEKT3 蛋白表達(dá)水平(r=0.483，P=0.013)均具有相關(guān)性。

3 討論

弱精子癥是引起男性不育的常見原因，其中精索靜脈曲張、睪丸炎、隱睪、附屬性腺感染等是弱精子癥常見的病因，然而多數(shù)的弱精子癥并不能明確其病因，被稱為特發(fā)性弱精子癥，特發(fā)性弱精子癥顯著的特征為精子活動力低下。

TEKT是精子鞭毛軸絲中與微管相關(guān)的蛋白家族［7］，最早發(fā)現(xiàn)于海膽精子鞭毛中［11］，哺乳動物中共有5種。TEKT3是TEKT家族中的一員，研究［8］表明從附睪尾部抽取的精子TEKT3可抵抗S-EDTA溶液的抽提，因此認(rèn)為其存在于纖毛軸絲周圍。免疫熒光顯微技術(shù)和免疫電鏡結(jié)果顯示TEKT3主要存在于線粒體與中段外周致密纖維表面，此外還存在于精子頭部赤道段，由此推斷TEKT3不僅可作為精子鞭毛一部分參與鞭毛的穩(wěn)定性，與精子活力相關(guān)，還參與了精卵結(jié)合和頂體反應(yīng)［12］。Roy 等［12］發(fā)現(xiàn)敲除小鼠tekt3基因后，小鼠產(chǎn)生的精子尾部缺陷率增加，精子活力顯著降低，但小鼠仍能夠繁殖后代，因此推測，tekt3基因敲除后小鼠產(chǎn)生的尾部缺陷精子仍具有完整的超活化能力。

人類tekt3基因位于17號染色體的短臂，包含9個外顯子，編碼含有490個氨基酸、相對分子質(zhì)量為53 900的蛋白。成年雄性小鼠tekt3基因編碼一個1 700 bp的轉(zhuǎn)錄本。小鼠與人類的TEKT3有83.5%的同源序列，包括一個在所有TEKT家族中都含有的九肽結(jié)構(gòu)［11］。纖毛蛋白質(zhì)學(xué)研究［7］表明TEKT3與TEKT1、TEKT2可能是軸絲9+2結(jié)構(gòu)的一部分，而TEKT5與TEKT3具有高度的相似性。

精子前向運動能力是精子與卵子結(jié)合形成受精卵的重要保障。哺乳動物精子的前向運動主要是靠尾部鞭毛擺動，而外周致密纖維和纖維鞘這兩種細(xì)胞骨架是精子尾部鞭毛擺動的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，精子尾部形態(tài)和結(jié)構(gòu)的異常可引起精子運動障礙和精子活力的改變。該研究結(jié)果顯示，TEKT3 mRNA和蛋白在正常對照組和特發(fā)性弱精子癥組精子中均表達(dá)，但特發(fā)性弱精子癥組精子TEKT3 mRNA和蛋白的表達(dá)水平較正常對照組明顯降低，并且前向運動精子率與TEKT3 mRNA和蛋白的表達(dá)均呈正相關(guān);表明TEKT3是影響精子活力的重要因素，TEKT3的表達(dá)降低可能引起精子鞭毛的缺陷增加和穩(wěn)定性降低，影響精子前向運動能力，從而導(dǎo)致男性不育。

TEKT家族蛋白表達(dá)具有高度相似性，敲除tekt4基因的雄性小鼠產(chǎn)生的精子能量利用低效甚至無效，而同時敲除TEKT3基因和TEKT4基因的雄性子鼠的精子既有結(jié)構(gòu)的缺陷又有能量利用的低效，雙重作用導(dǎo)致生育率的降低，然而仍能繁殖后代，表明TEKT家族其他的成員如TEKT1、TEKT2、TEKT5可能在功能上彌補(bǔ)了TEKT3和TEKT4雙重缺失所導(dǎo)致的缺陷［13］。因此同時檢測TEKT家族在精子中的表達(dá)，可能為闡明其在特發(fā)性弱精子癥中的作用機(jī)制提供更明確的指導(dǎo)。

綜上所述，TEKT3的表達(dá)水平與弱精子癥精子前向運動能力呈正相關(guān)，提示TEKT3可能成為弱精子癥發(fā)病機(jī)制研究的一個重要的靶標(biāo)，TEKT3表達(dá)水平下降的機(jī)制及其與TEKT家族成員的相互作用值得進(jìn)一步深入研究。

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