歐陽華，白 冰，趙 琳，任慧聰，張朝輝#

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院心身疾病二科新鄉(xiāng)453002 2)新密市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科新密452370

(2014-11-20收稿 責任編輯 王 曼)

海馬突觸的可塑性變化在抑郁癥的發(fā)病和治療方面有著至關(guān)重要的地位。研究［1］表明抑郁癥與一些腦區(qū)的功能和結(jié)構(gòu)的可塑性損傷有關(guān)，尤其是海馬區(qū)。抑郁癥與突觸的萎縮及突觸聯(lián)系的減少有關(guān)聯(lián)，而且這些神經(jīng)性改變是抑郁癥患者與海馬相關(guān)的認知缺損的基礎(chǔ)［2］。大量研究［3-4］表明，海馬與學習記憶(特別是空間認知功能)有關(guān)，CA3區(qū)被認為與空間辨別性學習記憶活動的關(guān)系尤為密切，如CA3區(qū)損傷可導致學習及記憶功能障礙。重復經(jīng)顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS)是在經(jīng)顱磁刺激基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項新型神經(jīng)電生理技術(shù)［5］。近年來國內(nèi)外研究［6-7］均表明rTMS在一定程度上能夠改善抑郁癥患者的認知功能障礙，但是其確切機制尚不完全明確。突觸素(synaptophysin，SYP)是突觸前區(qū)中重要的囊泡蛋白之一，對于突觸的形成和分泌是必需的。其表達可間接反映突觸的數(shù)量、密度和分布情況，是突觸可塑性的重要標志之一［8］。該研究通過給予抑郁模型大鼠rTMS，觀察大鼠學習記憶功能、海馬CA3區(qū)SYP的表達水平的變化，探討rTMS對抑郁大鼠學習記憶功能的影響及其可能的突觸可塑性機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 通過頻數(shù)表和箱式圖來判斷個體的行為學分數(shù)，按照統(tǒng)計學對離群數(shù)據(jù)的處理方法，篩選出評分均一、同質(zhì)性較高的雄性SD大鼠(SPF級)40只，體重200～250 g，6～8周齡，由河南省實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(豫)2010-0002，質(zhì)量合格證號:1009570。

1.2 實驗分組及處理方法 利用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為4組:rTMS組、偽刺激組、抑郁組及對照組，每組10只。除對照組外，其余3組大鼠均參考文獻［9］采用孤養(yǎng)結(jié)合慢性不可預見輕度應(yīng)激制備抑郁模型并進行模型評估。接受建模處理的大鼠孤養(yǎng)在獨立的籠內(nèi)，在21 d內(nèi)接受不同的應(yīng)激，應(yīng)激包括禁食24 h、禁水24 h、40℃高溫5 min、足底電刺激5 min、夾尾2 min、潮濕墊料24 h、晝夜顛倒24 h，7種應(yīng)激隨機安排，1種/d，每種應(yīng)激出現(xiàn)3次，同種應(yīng)激不能連續(xù)出現(xiàn)，使動物不能預料應(yīng)激的發(fā)生。采用蔗糖水消耗實驗及曠場實驗進行模型評估。rTMS組大鼠在造模成功后24 h行rTMS治療。采用武漢依瑞德公司生產(chǎn)的CCY-Ⅰ型磁刺激儀及環(huán)形動物線圈，線圈直徑約70 mm。刺激時固定大鼠頭部，線圈緊貼頭皮，與大鼠左側(cè)半球相切，線圈中心與大鼠額頂葉皮質(zhì)體表投影區(qū)中心重合，刺激頻率15 Hz，刺激量在100%MT，每天20串，每串80個脈沖，間歇10 s，共1 600次脈沖，連續(xù)5 d為1個療程，療程間隔2 d，共3個療程。偽刺激組置于相同的環(huán)境，線圈不通電，即無電流脈沖，只施予同樣次數(shù)的聲音刺激。

1.3 學習記憶功能的檢測 rTMS干預后，采用Morris水迷宮測試大鼠的學習記憶功能。參照Brightwell等［10］的方法，并結(jié)合課題做了部分改動。測試程序主要包括定位航行和空間探索實驗兩個部分。①定位航行實驗:連續(xù)訓練4 d，2次/d，間隔8 h，每個訓練時段4次，分別從四個象限入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠在水中尋找并爬上平臺的時間(即逃避潛伏期)，停留2 s為找到平臺。如果大鼠在90 s內(nèi)找不到平臺，將其引導至平臺，并在上面停留30 s，此時的逃避潛伏期記錄為90 s。以4 d內(nèi)的平均值作為學習成績。②空間探索實驗:于rTMS干預后第5天撤去平臺，于第一象限入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄其在2 min內(nèi)的運動軌跡，分析其在原平臺象限游泳時間及在原平臺象限游泳路程占總游泳路程的百分比，將其作為大鼠的記憶成績。

1.4 海馬SYP蛋白表達的檢測 在水迷宮測試結(jié)束后1 d內(nèi)，各組隨機選取6只大鼠，麻醉后多聚甲醛灌流內(nèi)固定，切取視交叉后4 mm處至小腦前的腦組織，置于多聚甲醛溶液中4℃過夜，再于蔗糖水溶液中4℃梯度脫水，最后用OCT組織包埋劑將整個大腦包埋成形，于－70℃保存?zhèn)溆?。SYP蛋白表達的檢測采用免疫組織化學SABC法。一抗SYP及生物素標記的二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司。DAB顯色，以PBS液代替一抗作為陰性對照。采用Leica Application Suite圖像采集系統(tǒng)，在400倍視野下對海馬 CA3區(qū)拍照，并用Image-Pro Plus圖像分析軟件測定每張圖片中陽性染色區(qū)域的平均光密度值，取同一只大鼠6張圖片的平均值表示海馬SYP蛋白的表達水平。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學分析。4組學習成績、記憶成績、海馬SYP蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準 α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠水迷宮測試結(jié)果 見表1。在定位航行實驗中，與對照組相比，rTMS組、偽刺激組、抑郁組的逃避潛伏期均延長，但rTMS組短于偽刺激組、抑郁組。在空間探索實驗中，4組大鼠的運動模式明顯不同。對照組大鼠探究能力更強、活動范圍更廣，均能快速地找到并爬上平臺;而抑郁組和偽刺激組大鼠活動范圍小，主要沿水迷宮周邊游動，較少向內(nèi)探索，找到平臺的時間較長，在原平臺象限游泳時間縮短，在原平臺象限游泳路程占總路程的百分比減小;rTMS組較抑郁組和偽刺激組大鼠明顯改善，在原平臺象限游泳時間及原平臺象限游泳路程占總路程的百分比較偽刺激組、抑郁組明顯延長和增大。

表1 4組大鼠水迷宮測試結(jié)果的比較

2.2 4組大鼠海馬SYP蛋白表達水平的比較 見圖1、表2。海馬CA3區(qū)SYP免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物呈板層樣分布于輻射層和始層的神經(jīng)氈內(nèi)，呈棕黃色點狀或顆粒狀，顆粒的大小與突觸類型及免疫反應(yīng)強弱有關(guān)。與對照組比較，抑郁組、偽刺激組CA3區(qū)SYP蛋白表達水平降低;與抑郁組、偽刺激組比較，rTMS組CA3區(qū)SYP蛋白表達水平升高，達對照組水平。

圖1 大鼠海馬CA3區(qū)SYP的表達(SABC，×400)A:對照組;B:抑郁組;C:偽刺激組;D:rTMS組。

表2 4組大鼠海馬CA3區(qū)SYP蛋白的表達

3 討論

rTMS的高場強磁脈沖信號可以連續(xù)不斷地透過顱骨，直接作用于大腦單側(cè)某一特定的皮質(zhì)部位，從而改善及調(diào)節(jié)腦功能［6］。該技術(shù)已在神經(jīng)、心理、精神等各個研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。研究［7］表明rTMS干預不會進一步惡化抑郁癥患者的認知功能，反而可以提高患者的工作執(zhí)行能力及客觀記憶力。既往Ahmed等［11］研究發(fā)現(xiàn)15 Hz的rTMS可以改善大鼠在新事物識別方面的能力。Tan等［12］發(fā)現(xiàn)1 Hz為期3周的rTMS治療可增進抑郁大鼠的空間參考記憶功能。該研究發(fā)現(xiàn)，rTMS干預能顯著改善抑郁大鼠學習記憶功能，與既往文獻報道結(jié)果一致。

SYP存在于突觸囊泡終端神經(jīng)鞘，構(gòu)成突觸囊泡特異性膜通道，被認為對突觸的可塑性是必需的［13］。該研究結(jié)果顯示，抑郁組大鼠海馬SYP蛋白表達水平較對照組降低，提示抑郁組大鼠海馬神經(jīng)元突觸數(shù)量減少，其可塑性受到影響。Kim等［14］研究表明慢性應(yīng)激可引起大鼠大腦結(jié)構(gòu)和功能的改變，尤其可導致海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元樹突的萎縮，表現(xiàn)為大鼠海馬區(qū) SYP 表達下調(diào)［15］。研究［16］顯示大鼠海馬神經(jīng)元缺血后變性壞死，學習和記憶功能下降，SYP陽性產(chǎn)物表達水平也明顯降低，提示SYP與學習記憶關(guān)系密切。宿寶貴等［17］研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Morris水迷宮測試訓練后大鼠空間辨別性學習記憶功能明顯增強，SYP蛋白的表達水平明顯增加，說明空間辨識性學習記憶活動可引起突觸的形態(tài)可塑性變化，SYP表達與學習記憶功能有直接關(guān)系。Sze等［18］研究表明，SYP蛋白的缺失與阿爾茲海默病認知功能的減退密切相關(guān)。該研究結(jié)果表明，對抑郁模型大鼠進行高頻rTMS治療后，大鼠的學習記憶功能明顯改善，同時海馬CA3區(qū)SYP蛋白表達水平上調(diào)，提示rTMS干預可改善抑郁大鼠學習記憶功能障礙，該作用可能與海馬CA3區(qū)SYP的表達改變有關(guān)。

rTMS對抑郁癥認知功能障礙的治療效果雖然顯著，但還有許多問題亟待解決。海馬的學習記憶功能是通過海馬神經(jīng)環(huán)路實現(xiàn)的，該研究只對其中一部分進行了研究，因此，今后可運用電生理技術(shù)進一步探討rTMS改善認知功能障礙的作用機制，并深入探索rTMS獨特的作用機制和引起的生物學效應(yīng)及分子水平的變化。

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