宋艷敏，李日恒，張濤，賈佳，馬芳，趙立華（. 河北大學(xué)臨床學(xué)院，河北 保定 07000；. 河北大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科，河北 保定 07000)

結(jié)直腸癌中PAQR3甲基化水平及mRNA表達(dá)的研究

宋艷敏1，李日恒2，張濤2，賈佳2，馬芳2，趙立華2
（1. 河北大學(xué)臨床學(xué)院，河北 保定 071000；2. 河北大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科，河北 保定 071000)

目的 研究結(jié)直腸癌組織中抑癌基因PAQR3 mRNA表達(dá)情況及甲基化水平，探討PAQR3基因異常甲基化與結(jié)直腸癌的關(guān)系。方法 收集結(jié)直腸癌及正常組織標(biāo)本54組，用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)結(jié)直腸癌標(biāo)本中PAQR3 mRNA表達(dá)水平；用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（MSP）法檢測(cè)結(jié)直腸癌標(biāo)本中PAQR3基因甲基化水平，用以分析PAQR3甲基化水平與臨床病理資料的關(guān)系。結(jié)果 54組結(jié)直腸癌標(biāo)本中PAQR3 mRNA表達(dá)降低發(fā)生率為57.4%（31/54），正常組織PAQR3 mRNA表達(dá)降低發(fā)生率為18.5%（10/54），表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.000）；癌組織PAQR3基因啟動(dòng)子甲基化發(fā)生率為33.3 %（18/54），正常組織PAQR3基因啟動(dòng)子甲基化率為5.6 %（3/54），二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.000）；PAQR3基因甲基化與年齡、分化程度、浸潤(rùn)深度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與性別、部位無(wú)關(guān)。結(jié)論 結(jié)直腸癌組織中PAQR3表達(dá)降低，與其基因啟動(dòng)子發(fā)生高甲基化有關(guān)。

PAQR3；結(jié)直腸癌；甲基化；MSP

本文引用：宋艷敏, 李日恒, 張濤, 等.結(jié)直腸癌中PAQR3甲基化水平及mRNA表達(dá)的研究[J].醫(yī)學(xué)研究與教育, 2015, 32(1): 55-60.

近年來(lái)，結(jié)直腸癌的發(fā)生率越來(lái)越高，已高居世界腫瘤惡性腫瘤第3位，死亡率第 4位。結(jié)直腸癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療對(duì)于結(jié)直腸癌患者生命及生活質(zhì)量的提高具有重要意義。結(jié)直腸癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟共同作用的結(jié)果。結(jié)直腸癌的發(fā)生與基因突變、異常甲基化等密切相關(guān)，基因啟動(dòng)子甲基化屬于表觀遺傳學(xué)改變，是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNA Methyltransferase，DNMT）的作用下，將S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）上的甲基基團(tuán)共價(jià)結(jié)合到CpG二核糖酸的胞嘧啶的5碳位（5m-C）上的過(guò)程，基因在特定環(huán)境的刺激下發(fā)生甲基化，目的是保護(hù)DNA特定位點(diǎn)不受特定酶的影響而發(fā)生降解，進(jìn)一步調(diào)節(jié)基因表達(dá)，此反應(yīng)是可逆的，是腫瘤發(fā)生的早期事件[1-2]。因此檢測(cè)基因甲基化為結(jié)直腸癌的早期診斷以及探討發(fā)生機(jī)理提供了依據(jù)。通過(guò)研究PAQR3甲基化水平與結(jié)直腸癌的關(guān)系，進(jìn)一步指導(dǎo)結(jié)直腸癌診斷及治療。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1組織標(biāo)本

54對(duì)結(jié)直腸癌組織、正常組織取自河北大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科，收集標(biāo)本時(shí)間為2013—2014年，納入標(biāo)準(zhǔn)：患者術(shù)前均未接受過(guò)放化療，其中男28例，女26例；直腸癌26例，結(jié)腸癌28例；年齡36～82歲，平均年齡59.69歲。術(shù)中立即取標(biāo)本放置于液氮中，并于-80℃低溫冰箱內(nèi)保存，時(shí)間不超過(guò)6個(gè)月。

1.1.2試劑及檢測(cè)儀器

高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Thermo Electron LED GmbH Am Kalkberg，Thermo Sorvall ST16R），全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（基因有限公司，EPOCH），全自動(dòng)凝膠成像儀（中國(guó)容智創(chuàng)業(yè)，ChampGel 5000），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司，7300），普通PCR儀器（美國(guó)Applied Biosystems公司，Veriti）。Omega E.Z.N.A.TM總RNA提取試劑盒、Vazyme Hiscript 第一鏈cDNA合成試劑盒、Vazyme Hiscript qRT PCR熒光定量試劑盒、E.Z.N.A.組織DNA提取試劑盒、QIAGEN EpiTect Fast DNA Bisulfite試劑盒、蛋白酶K、RNaseA均由石家莊市惠友生物科技有限公司提供，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成提供，實(shí)驗(yàn)中所需的STE裂解液、SDS、氯仿、異戊醇、無(wú)水乙醇、Tris-飽和酚、酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）、氯仿/異戊醇（24∶1）等均由河北大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法

1.2.1組織RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、PCR

1.2.1.1組織RNA提取 取30 mg的組織，液氮研磨，按照Omega E.Z.N.A.TM總RNA提取試劑盒方法提取RNA，取產(chǎn)物2μL于1%的瓊脂糖凝膠電泳中，全自動(dòng)凝膠成像儀下觀察并記錄結(jié)果，酶標(biāo)儀檢測(cè)含量（2000）及比值（OD∶1.9-2.0）合適后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，中途不能及時(shí)完成時(shí)將產(chǎn)物放置-20 ℃或-80 ℃低溫保存，保存時(shí)間不超過(guò)3個(gè)月。

1.2.1.2RNA反轉(zhuǎn)錄 各取總RNA 1μL，根據(jù)Vazyme Hiscript 第一鏈cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，體系為Oligo dT 1μL，總RNA 1μL，RNase free ddH2O 6μL， 65 ℃預(yù)熱10 min，冰上驟冷2 min。隨后加入2×RT Mix 10μL，Hiscript Enzyme Mix 2μL，25 ℃，5 min；42 ℃，30 min；85 ℃，5 min，產(chǎn)物進(jìn)行分裝稀釋?zhuān)胖糜?20 ℃，保存時(shí)間不超過(guò)6個(gè)月，用以進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。

1.2.1.3PCR PCR引物根據(jù)Primer premier 5.0設(shè)計(jì)，并通過(guò)Pubmed blast檢測(cè)其特異性，反應(yīng)體系20μL，PAQR3引物：5′-TCTGTATGCTTTGCTCTGTGGG-3′（F），5′-TTTGCCATTGCTGCGTGAG-3′（R），產(chǎn)物長(zhǎng)度 252 bp。內(nèi)參基因β-actin引物：5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′（F），5′-AAAGGGTGTAACGCAACTAA-3′（R），產(chǎn)物長(zhǎng)度：302 bp。模板cDNA 2μL，Mix 10μL，Rox 2μL，上下游引物2μL，滅菌蒸餾水4μL，反應(yīng)條件：95 ℃，5 min；95 ℃，10 s ；60 ℃，32 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s。擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，全自動(dòng)凝膠成像儀下分析。

1.2.2組織DNA提取、亞硫酸氫鹽修飾、MSP

1.2.2.1酚/氯仿抽提法提取組織DNA 取30 mg組織研磨，根據(jù)酚/氯仿抽提法提取組織DNA，加入15μL的TE緩沖液，輕輕吹打混勻，隨即在酶標(biāo)儀上檢測(cè)DNA含量，含量在1～2μg/μL（OD：1.8-1.9），取2μL DNA液、1μL 5×loading buffer混勻，在電壓20 V，1%瓊脂糖凝膠電泳下跑電泳30 min，在全自動(dòng)凝膠成像儀下分析并記錄DNA提取結(jié)果。

1.2.2.2亞硫酸氫鹽修飾 根據(jù)QIAGEN 的EpiTect Fast DNA Bisulfit Kit 試劑盒進(jìn)行甲基化處理，將DNA1μg、RNase-free water 10μL、Bisulfite Solution 85μL、DNA Protect Buffer 35μL組成的140μL體系混勻，在普通PCR儀上，95 ℃，5 min；60 ℃，20 min；95 ℃，5 min；60 ℃，20 min；20 ℃，30 min進(jìn)行處理，結(jié)束后將體系轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入310μL buffer BL，渦旋混勻后離心；加入250μL的無(wú)水乙醇，最大速度渦旋15 s，離心1 min，轉(zhuǎn)移以上液體至MinElute DNA柱子及收集管，離心1 min，棄濾液，加入500μL的Buffer BW，離心1 min，棄濾液；加500μL Buffer BD，室溫孵育15 min，離心1 min，棄濾液；加500μL Buffer BW，離心1 min，棄濾液；重復(fù)加入500μL Buffer BW，離心1 min，棄濾液；加入250μL的無(wú)水乙醇，離心1 min，將柱子轉(zhuǎn)移至新的收集管中，離心1 min，柱子敞開(kāi)蓋子空氣風(fēng)干10 min，以蒸發(fā)殘余液體；將柱子轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入15μL的Buffer EB，室溫靜置1 min，離心洗滌DNA，分裝稀釋?zhuān)?20 ℃保存，以進(jìn)行MSP。

1.2.2.3甲基化特異性PCR（Methylation Specific PCR，MSP） 甲基化引物（M）：5′-TTGTTGAAGAGCGCGTATTATATC-3′（F），5′-TAAAAAACCCGAAAATCTACTCGTA-3′（R）。產(chǎn)物長(zhǎng)度：109 bp。非甲基化引物（U）：5′-TTGTTGAAGAGTGTGTATTATATTGA-3′（F），5′-TAAAAAACCCAAAAATCTACTCATA-3′（R）。產(chǎn)物長(zhǎng)度：109 bp。MSP反應(yīng)體系25μL，模板 DNA 2.5μL，Mix 10μL，Rox 2μL，上下游引物4μL，滅菌蒸餾水4μL。反應(yīng)條件：95 ℃，10 min；95 ℃，10 s；60 ℃，50 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s。擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外分析儀分析。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

根據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0，計(jì)數(shù)資料比較采用Fisher’s確切概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，為雙側(cè)檢驗(yàn)，結(jié)果以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1結(jié)直腸癌組織中PAQR3 mRNA RT-PCR凝膠電泳

PAQR3 mRNA RT-PCR結(jié)果顯示，癌組織中PAQR3 mRNA水平表達(dá)降低，甚至不表達(dá)，正常組織中高表達(dá)（圖1）；54組標(biāo)本中有31個(gè)結(jié)直腸癌組織中PAQR3 mRNA水平表達(dá)降低，10個(gè)正常組織中PAQR3 mRNA水平表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）（圖2）。

圖1　組織PAQR3 mRNA 擴(kuò)增后的凝膠電泳

圖2　PAQR3在癌組織及正常組織中RT-PCR表達(dá)

2.2結(jié)直腸癌組織中PAQR3基因甲基化狀態(tài)

在31組PAQR3 mRNA 表達(dá)降低的患者中，有12組結(jié)直腸癌組織中PAQR3基因發(fā)生部分甲基化，6組發(fā)生完全甲基化，13組未發(fā)生甲基化（圖3），甲基化引物擴(kuò)增，且非甲基化引物擴(kuò)增者為甲基化陽(yáng)性；甲基化引物未擴(kuò)增，非甲基化引物擴(kuò)增者為甲基化陰性。在其余23組PAQR3表達(dá)未明顯下降的結(jié)直腸癌患者中，有3組癌組織發(fā)生部分甲基化，20組患者未發(fā)生甲基化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。

圖3　部分結(jié)直腸癌組織PAQR3基因MSP電泳

2.3PAQR3基因甲基化與結(jié)直腸癌臨床資料之間的關(guān)系

統(tǒng)計(jì)軟件通過(guò)Fisher’s確切概率法檢驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，PAQR3 DNA 甲基化水平與性別、部位無(wú)關(guān)，與年齡、分化程度、浸潤(rùn)深度、臨床分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1　結(jié)直腸癌組織中PAQR3基因甲基化水平與臨床資料之間的關(guān)系

3　討論

基因甲基化是一個(gè)動(dòng)態(tài)可逆的過(guò)程，基因異常甲基化是腫瘤發(fā)生的早期事件，許多基因甲基化與結(jié)直腸癌的發(fā)生有關(guān)。PAQR3是2009年被陳雁教授發(fā)現(xiàn)的，在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌基因的作用，參與了細(xì)胞的各種信號(hào)通路，影響能量代謝、細(xì)胞分裂增殖、分化以及生殖細(xì)胞成熟等生物學(xué)過(guò)程，又名PKTG，可以編碼出37 ku，N端朝胞質(zhì)、C端朝細(xì)胞器、位于高爾基體膜上的7次跨膜蛋白，能負(fù)性調(diào)控Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路，此信號(hào)通路是經(jīng)典的絲裂原活化蛋白激酶級(jí)聯(lián)信號(hào)途徑之一，PAQR3競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合于RAF，干擾RAF與下游信號(hào)分子、底物的結(jié)合[3]，感受細(xì)胞外信號(hào)、控制細(xì)胞增殖分化及存活，作用就是將胞外的刺激信號(hào)傳遞至胞內(nèi)，達(dá)到調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、癌癥的發(fā)生、發(fā)展等生理過(guò)程的目的[4-6]。目前已被證實(shí)在結(jié)直腸癌組織中發(fā)揮抑癌作用，PAQR3表達(dá)缺失減少了敲除基因裸鼠的存活時(shí)間[7]。人類(lèi)黑色素瘤A375中，PAQR3過(guò)表達(dá)能明顯抑制細(xì)胞的擴(kuò)增及惡性轉(zhuǎn)化，裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)si-RNA技術(shù)使PAQR3重新表達(dá)能明顯抑制皮下成瘤的作用，其下游被異常激活的ERK活性明顯受到抑制[8]，除此之外，PAQR3也被證明在胃癌、乳腺癌等腫瘤組織中表達(dá)降低，PAQR3能增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3對(duì)表柔比星的敏感性[9]。

PAQR3基因沉默的機(jī)制仍不清楚，檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中基因啟動(dòng)子甲基化水平，來(lái)探討它們之間的關(guān)系，研究顯示，PAQR3在結(jié)直腸癌組織中較正常組織表達(dá)降低，發(fā)生率為57.4%，MSP顯示，PAQR3在結(jié)直腸癌組織中發(fā)生甲基化的概率為33.3%，DNA 甲基化水平與性別、部位無(wú)關(guān)，與年齡、分期、分化程度、浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨著年齡的增大，分期越高，分化程度越低、淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移者，PAQR3 基因啟動(dòng)子甲基化水平越高；反之，PAQR3基因啟動(dòng)子甲基化水平越低?；蚣谆c年齡有關(guān)，隨著年齡的增大，機(jī)體甲基化水平越高，年齡相關(guān)的甲基化水平改變的機(jī)制仍不是很明確，但普遍認(rèn)為是地理環(huán)境以及隨機(jī)抽樣所致[10]。PAQR3甲基化水平高與分期、分化程度、浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，是由PAQR3沉默所致。

分析概率低的原因，結(jié)直腸癌的形成是一個(gè)復(fù)雜、涉及多個(gè)基因、多種機(jī)制的過(guò)程，PAQR3的表達(dá)降低只是其中的一個(gè)因素，而甲基化導(dǎo)致的PAQR3基因表達(dá)沉默或缺失只是其中一個(gè)因素，所以發(fā)生的概率偏低；此外可能受地域、樣本量等因素的影響。通過(guò)研究證明，PAQR3在結(jié)直腸癌中的表達(dá)降低及缺失確實(shí)與基因啟動(dòng)子甲基化有關(guān)，雖然發(fā)生率低，但在龐大的結(jié)直腸癌基數(shù)中，了解這一機(jī)制也能為疾病的診斷及治療提供指導(dǎo)作用。

此外，后續(xù)將會(huì)檢測(cè)多個(gè)結(jié)直腸細(xì)胞系中PAQR3的甲基化水平，通過(guò)甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑逆轉(zhuǎn)甲基化[11]，探討逆轉(zhuǎn)后PAQR3表達(dá)水平及在裸鼠成瘤方面的影響，進(jìn)一步為結(jié)直腸癌的診斷和治療提供一些依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：劉俊華）

The methylation and mRNA expression of PAQR3 in colorectal cancer

SONG Yanmin1, LI Riheng2, ZHANG Tao2, JIA Jia2, MA Fang2, ZHAO Lihua2
(1. College of Clinical Medicine, Hebei University, Baoding 071000, China; 2. Department of General Surgery, Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding 071000, China)

Objective To investigate the relationship between the methylation level of PAQR3 and colorectal cancer, the methylation level and mRNA expression of PAQR3 gene in colorectal cancer were detected. Methods 54 colorectal cancers and 54 colorectal normal tissues were collected to detect the expression of mRNA level by reverse transcriptase PCR(RT-PCR), the methylation level of PAQR3 gene were detected by Methylation Specific PCR(MSP), which were used to analyze the relationship between methylation of PAQR3 and clinical data. Results Expression of PAQR3 mRNA in 54 normal tissues were significantly higher than that in 54 colorectal cancer tissues , the expression rates were 18.5%(10/54) and 57.4%(31/54), there was significant difference between cancer and normal tissues(P= 0.000).The PAQR3 gene promoter methylation rate of colorectal cancer and colorectal normal tissues were 33.3%(18/54)and 5.6 %(3/54), there was significant difference between cancer and normal tissues(P= 0.000).There was significant difference in age, differentiation, infiltration, clinical stage and the metastasis of lymph node in colorectal cancer, but not in sex and location.Conclusion PAQR3 expression can be reduced in colorectal cancer, PAQR3 gene promoter hypermethylation may play an important role in oncogenesis of colorectal cancer.

PAQR3; colorectal cancer; methylation; MSP

10.3969/j.issn.1674-490X.2015.01.013

R656.9

A

1674-490X(2015)01-0055-06

2014-11-19

宋艷敏 （1986—），女，河北滄州人，在讀碩士。 E-mail: songyanmin1211@sina.com

李日恒 （1972—）， 男，黑龍江齊齊哈爾人，副主任醫(yī)師，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事結(jié)直腸及血管外科疾病的基礎(chǔ)及臨床研究。E-mail: LRH1120@21cn.com