張樂(lè)，朱虹，2，韋坤華，張春紅，2，李旻輝，2*

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)特色藥用植物培育與保護(hù)工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 包頭 014060；3.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530023)

·基礎(chǔ)研究·

沙苑子與其混偽品的ITS序列分子鑒別研究△

張樂(lè)1，朱虹1，2，韋坤華3，張春紅1，2，李旻輝1，2*

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)特色藥用植物培育與保護(hù)工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 包頭 014060；3.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530023)

目的：研究沙苑子與其混偽品之間的DNA分子鑒別方法。方法：采集不同產(chǎn)地的沙苑子藥材10份，基原植物2份，達(dá)烏里黃芪3份，蒙古黃芪4份，直立黃芪3份，混偽品豬屎豆和凹葉野百合各1份，所有樣品進(jìn)行總DNA的提取，PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序得到相應(yīng)的序列，用MEGA計(jì)算其種間的K-2-P距離，最后利用ITS序列構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果：測(cè)得了24份樣品的ITS序列全長(zhǎng)，分別為沙苑子644～688 bp，蒙古黃芪為646～673 bp；直立黃芪685～687 bp；達(dá)烏里黃芪為676～688 bp；豬屎豆為785 bp；凹葉野百合為837 bp。通過(guò)以ITS序列重建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行的聚類(lèi)分析可以將沙苑子與其混偽品有效的區(qū)分開(kāi)。用MEGA軟件基于ITS序列構(gòu)建的沙苑子與其混偽品間的遺傳距離分析得到了沙苑子與達(dá)烏里黃芪的種間K-2-P距離0.080 2；蒙古黃芪為0.081 2，與直立黃芪之間的遺傳距離為0.082 4，凹葉野百合和豬屎豆與沙苑子的遺傳距離稍大，達(dá)到0.236 2和0.229 9。用MEGA軟件測(cè)定沙苑子種內(nèi)遺傳距離為0.001 0。此外，對(duì)通過(guò)測(cè)定種間的遺傳距離發(fā)現(xiàn)，蒙古黃芪與直立黃芪種間的遺傳距離最小為0.000 9，與豬屎豆種間的遺傳距離最大為0.236 2。結(jié)論：ITS序列能夠成功鑒定沙苑子及其混偽品，可以作為沙苑子與其混偽品的分子鑒別方法。

沙苑子；ITS序列；分子鑒別

沙苑子為豆科植物扁莖黃芪AstragaluscomplanatusR.Br.的干燥成熟種子，為臨床常用中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論認(rèn)為沙苑子具有溫補(bǔ)肝腎、固精、縮尿、明目的功能，用于腎虛腰痛、遺精早泄、白濁帶下、小便余瀝、眩暈?zāi)炕璧萚1]。隨著沙苑子有效成分的深入研究，沙苑子資源廣泛開(kāi)發(fā)和利用，市場(chǎng)對(duì)沙苑子資源的需求急劇增加。通過(guò)調(diào)查發(fā)現(xiàn)近年來(lái)市場(chǎng)上除了正品沙苑子外，尚有偽品和混淆品存在，如直立黃芪種子、達(dá)烏里黃芪種子、蒙古黃芪種子、豬屎豆種子、凹葉野百合種子等，這些藥材在外形上與沙苑子極為相近，但在藥效方面相差甚遠(yuǎn)，有些甚至具有毒性。因此，準(zhǔn)確的鑒別沙苑子藥材對(duì)于保障人們用藥安全意義重大。

市面上銷(xiāo)售的沙苑子大多為加工過(guò)的藥材。由于沙苑子與其混偽品的性狀、顯微特征等都極為相似，因此在實(shí)際運(yùn)用中要準(zhǔn)確鑒別存在一定難度。同時(shí)應(yīng)用形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和化學(xué)成分分析等方法來(lái)鑒定沙苑子，具有主觀性較強(qiáng)、特異性較弱、通用性差、對(duì)觀察者經(jīng)驗(yàn)要求高等缺陷，不利于規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化方法的建立及普及。而DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)具有快速、微量、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，為藥材的鑒別提供了客觀而有效的手段[2-6]。本研究采用rDNA-ITS序列差異分析的方法，對(duì)沙苑子藥材和基源植物及其混偽品豬屎豆、達(dá)烏里黃芪、直立黃芪，蒙古黃芪和凹葉野百合的遺傳關(guān)系作深入的研究，為準(zhǔn)確進(jìn)行沙苑子與其混偽品的鑒別提供科學(xué)的客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 儀器 PCR儀(德國(guó)Eppendorf型號(hào)5332)，電泳系統(tǒng)(北京市六一儀器廠，型號(hào)DYY-12)，低溫冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf 型號(hào)5810 R)，紫外凝膠成像分析儀(英國(guó)Syngene型號(hào)GBOXHR)，混合型球磨儀(德國(guó)Retseh 型號(hào)MM400)，數(shù)控超聲波清洗器(型號(hào)KQ-SOODE)，微量移液器(德國(guó)Eppendorf)。

1.1.2 試劑 2 x CTAB提取液，1 x TAE緩沖液，瓊脂糖(Promega公司)，溴化乙錠(Flulka公司)，DNA Tag聚合酶(Takara公司)，2000 bp DNA Markar(Takara公司)，三氯甲烷、無(wú)水乙醇、異丙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 供試樣品 實(shí)驗(yàn)材料沙苑子種子及原植物、豬屎豆種子、達(dá)烏里黃芪種子、直立黃芪種子，蒙古黃芪種子等樣品均經(jīng)內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院李旻輝教授鑒定，采集信息見(jiàn)表1。沙苑子通常略呈腎形而稍扁，長(zhǎng)2～2.5 mm，寬1.5～2 mm，厚約l mm。表面光滑，褐綠色或灰褐色，邊緣一側(cè)微凹處具圓形種臍。質(zhì)堅(jiān)硬，不易破碎。子葉2，淡黃色，胚根彎曲，長(zhǎng)約l mm。氣微，味淡，嚼之有豆腥味。通過(guò)與當(dāng)?shù)厮幉纳踢M(jìn)行核實(shí)確定，并根據(jù)藥材商進(jìn)貨時(shí)留下的收據(jù)信息來(lái)核對(duì)樣品，進(jìn)而保證對(duì)廣西、四川、河北等三個(gè)不同地區(qū)的沙苑子收集的準(zhǔn)確性。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總DNA提取 取每份樣品單粒種子0.3 mg，研磨破碎裝入微量離心管中，加入適量預(yù)熱的2 x CTAB提取液，用振蕩器將樣品搖勻，加入適量巰基乙醇，混勻，放在65 ℃水浴鍋中水浴1.5 h，取出材料置于室溫下冷卻，加入適量氯仿-異戊醇(24∶1)溶液，用力搖勻5 min，高速離心10 min(12 000r·min-1)，取上清液，加入等體積的氯仿-異戊醇(24：1)溶液，用力搖勻 5 min，高速離心10 min，取上清液，加入適量異丙醇，輕輕顛倒2-3次，放在-20 ℃冰箱里靜置30 min，高速離心10 min，棄上清，用70%乙醇及無(wú)水乙醇分別洗2次，最后放在37 ℃烘箱中烘20～30 min，使乙醇揮發(fā)徹底，加入適量滅菌蒸餾水，使之溶解，放在-20 ℃或4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實(shí)驗(yàn)材料采集地

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 選擇目前國(guó)際推薦的通用引物ITS(ITS4/ITS5)。

ITS4：5′-TCCTCCGCTTATT-GATATGC-3′；

ITSS：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAA-CAAGG-3′。

1.2.3 DNA擴(kuò)增 反應(yīng)體系總體積為25 μL，包括10 x buffer緩沖液2.5 μL，dNTP 1.0 μL，引物各2.5 μL，ExTag酶0.2 μL，DNA 1 μL，滅菌蒸餾水19.8 μL。反應(yīng)條件：解鏈溫度95 ℃，時(shí)間5 min，退火溫度56 ℃，時(shí)間30 s，復(fù)性溫度72 ℃，時(shí)間1 min 40 s，延伸溫度72℃，時(shí)間7 min，循環(huán)次數(shù)為35個(gè)，最后4 ℃保存。

1.2.4測(cè)序 經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，PCR原產(chǎn)物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序部測(cè)序，各樣品均采用雙向測(cè)序。

1.2.5 序列分析 將6種藥材的24個(gè)個(gè)體進(jìn)行序列的比對(duì)分析，所得DNA序列用CONTIG軟件同源對(duì)齊，并輔以人工校對(duì)。以盡量減少排列所缺失的數(shù)口；排序后的序列使用BioEdit分析軟件進(jìn)行分析處理。用MEGA 5分別計(jì)算各樣品ITS序列的差異性(Kimura 2-parameter)，并采用鄰接法(NJ法)和非加權(quán)平均法(UPGMA法)分別構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并以Bootstrap作1000次可信度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙苑子與其混偽品的ITS序列特征

本實(shí)驗(yàn)測(cè)得了沙苑子與其混偽品的24份樣品ITS序列，ITS全序列長(zhǎng)度為644～837 bp，分別為沙苑子644～688 bp，其中(G+C)%為52.69%～53.34%；蒙古黃芪為646～673 bp，其中(G+C)%為46.51%～53.08%；直立黃芪685～687 bp，其中(G+C)%為52.11%～52.4%；達(dá)烏里黃芪為676～688 bp，其中(G+C)%為51.74%～52.42%；豬屎豆為785 bp，其中(G+C)%為58.22%；凹葉野百合為837 bp，其中(G+C)%為54.96%。

2.2 沙苑子與其混偽品間的遺傳距離分析

用MEGA軟件基于ITS序列構(gòu)建的沙苑子與其混偽品間的遺傳距離分析得到了沙苑子與其混偽品蒙古黃芪、直立黃芪、達(dá)烏里黃芪、凹葉野百合及豬屎豆間的種間K-2-P距離，其中達(dá)烏里黃芪與沙苑子的種間K-2-P距離最小(0.080 2)；其次是蒙古黃芪為0.081 2)，直立黃芪與沙苑子之間的遺傳距離為(0.0824)，凹葉野百合和豬屎豆與沙苑子的遺傳距離稍大，達(dá)到0.236 2和0.229 9。(見(jiàn)表2)用MEGA軟件測(cè)定沙苑子種內(nèi)遺傳距離為0.001 0。通過(guò)測(cè)定混偽品間K-2-P距離發(fā)現(xiàn)，蒙古黃芪與直立黃芪種間的遺傳距離最小為0.0009，與豬屎豆種間的遺傳距離最大為0.236 2(見(jiàn)表3)。

2.3 沙苑子與其混偽品系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

為了盡可能減少因系統(tǒng)誤差對(duì)所構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)的影響，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)ITS序列特征采用NJ法和UPGMA法分別構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1及圖2)。

表2 基于ITS序列構(gòu)建的沙苑子與其混偽品間的遺傳距離

表3 基于ITS序列構(gòu)建的混偽品的種間距離

圖1 基于ITS序列構(gòu)建的沙苑子及混偽品的NJ樹(shù)

圖2 基于ITS序列構(gòu)建的沙苑子與其混偽品的UPGMA樹(shù)

2種方法均采用Kimura 2-parameter距離，系統(tǒng)樹(shù)各分支的置信度用自展法(bootstrap method)檢驗(yàn)，共進(jìn)行1000次循環(huán)，以評(píng)價(jià)分支的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義與可靠性。由圖1可以看出，通過(guò)NJ法建立的系統(tǒng)樹(shù)進(jìn)行聚類(lèi)可以分成3個(gè)大組，第1大組為不同產(chǎn)地沙苑子，第2大組為直立黃芪、達(dá)烏里黃芪及蒙古黃芪，其中直立黃芪和達(dá)烏里黃芪體聚在了一起，蒙古黃芪和直立黃芪以及達(dá)烏里黃芪能夠分開(kāi)，第3大組為豬屎豆和凹葉野百合，其中在系統(tǒng)樹(shù)分支上可以看出，蒙古黃芪，達(dá)烏里黃芪及直立黃芪分支相比豬屎豆、凹葉野百合要近一些，說(shuō)明它與沙苑子遺傳關(guān)系近些，達(dá)烏里黃芪和直立黃芪這2個(gè)物種在分類(lèi)支上顯示遺傳關(guān)系也比較近些。通過(guò)系統(tǒng)樹(shù)聚類(lèi)分析可以將沙苑子與其混偽品直立黃芪、蒙古黃芪、達(dá)烏里黃芪、豬屎豆和凹葉野百合有效鑒別開(kāi)。結(jié)果表明ITS序列可以用于鑒別沙苑子與其混偽品，可以成為沙苑子與其混偽品鑒定分析的有效手段，對(duì)保證沙苑子藥材安全及植物資源合理利用具有重要意義。

3 討論

通過(guò)對(duì)購(gòu)于市場(chǎng)上沙苑子藥材的調(diào)查結(jié)果表明：目前市售沙苑子主流商品為扁莖黃芪的種子，屬藥典規(guī)定品種，但在少數(shù)地區(qū)仍有混雜使用直立黃芪和紫云英的情況。在河北安國(guó)藥材市場(chǎng)，成都蓮花池及廣西玉林藥材市場(chǎng)上所收集的24份沙苑子藥材樣品中，并未出現(xiàn)曾報(bào)道過(guò)的凹葉野百合、田皂角、直立黃芪和華黃芪等充當(dāng)沙苑子現(xiàn)象。

由于沙苑子屬較細(xì)小種子類(lèi)，據(jù)報(bào)道沙苑子有多種混偽品，這些混偽品與正品種屬比較接近[7-8]，然而運(yùn)用傳統(tǒng)的鑒別方法在藥材鑒定方面還未達(dá)到理想的快速、準(zhǔn)確鑒定的目的。傳統(tǒng)的中藥材鑒定方法主要基于形態(tài)及化學(xué)特征，但是二者均受環(huán)境和生物生長(zhǎng)發(fā)育等各種因素的限制，無(wú)法滿足中藥產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化發(fā)展的需求，DNA 條形碼技術(shù)具有較強(qiáng)的通用性，已作為藥用植物準(zhǔn)確鑒定的重要手段，倍受?chē)?guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注[9-11]。本研究采用DNA條形碼技術(shù)對(duì)市場(chǎng)上采購(gòu)的沙苑子藥材進(jìn)行鑒別。由于DNA濃度會(huì)直接影響PCR擴(kuò)增效率，因此取樣過(guò)程中盡可能避免存有雜質(zhì)，提高PCR擴(kuò)增的效率。據(jù)K-2-P距離遺傳分析，正品沙苑子各基源植物種內(nèi)平均K-2-P距離遠(yuǎn)小于其與混偽品的種間K-2-P距離。因此ITS序列作為條形碼，能將沙苑子藥材與混偽品進(jìn)行很好的區(qū)分，從而達(dá)到準(zhǔn)確鑒定的目的。不僅為沙苑子藥用植物正本清源，保證藥材安全及植物資源合理利用提供保證，還是對(duì)傳統(tǒng)鑒別方法的有效補(bǔ)充和科學(xué)完善，對(duì)保障沙苑子藥材用藥安全具有重要意義。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：145.

[2] 趙林.沙苑子及其偽品混用品的性狀鑒別[J].中國(guó)基層醫(yī)藥，2005，12(12)：101.

[3] 崔占虎，李越，袁慶軍，等.黃芪與其混偽品的 ITS 序列分子鑒定研究[J].中國(guó)中藥雜志，2012，37(24)：3773-3776.

[4] 車(chē)建，唐琳，劉彥君，等.ITS 序列鑒定西紅花與其易混中藥材[J].中國(guó)中藥雜志，2007，32(8)：668-671.

[5] 劉春生，白根本，閻玉凝.基于核 DNA ITS 序列的細(xì)辛藥材基源及分子鑒定研究[J].中國(guó)中藥雜志，2005，30(5)：329-332.

[6] 許亮，竇德強(qiáng)，王冰，等.牛蒡子及其偽品的 ITS 序列分子鑒定研究[J].中國(guó)中藥雜志，2011，36(3)：338-341.

[7] 畢培曦，李慧云，方三曼.沙苑子及其混淆品之鑒別.藥物分析雜志，1988，8(4)：210.

[8] 劉篤義.沙苑子與直立黃芪.中藥材，1990，13(7)：25.

[9] Pang X，Song J，Zhou U，et al.Applying plat DNA barcodes for Rosaceae species identification[J].Cladistics，2011，27(2)：165.

[10] Song J，Shi L，Li D，et al.Extensive pyrosequencing reveals frequent intra-genomic variations of internal transcribed spacer regions of nuclear ribosomal DNA[J].PLoS ONE，2012，7(8)：e43971.

[11] Gu W，Song J，Cao Y，et al.Application of the ITS2 region for barcoding medicinal plants of Selaginellaceae in Pteridophyta[J].PLoS ONE，2013，8(6)：e67818.

MolecularIdentificationofAstragaluscomplanatusanditsAdulterantsbyITSSequences

ZHANGLe1，ZHUHong1，2，WEIKunhua3，ZHANGChunhong1，LIMinhui1，2*

(1.BaotouMedicalCollege，Baotou，InnerMongolia014060，China；2.InnerMongoliaResearchCenterofCharacteristicMedicinalPlantsCultivationandProtectionEngineeringTechnology，Baotou，InnerMongolia014060，China；3.GuangxiKeyLaboratoryofMedicinalResourcesProtectionandGeneticImprovement，GuangxiBotanicalGardenofMedicinalPlants，Nanning530023，China)

Objective：To explore a new method for identification ofAstragaluscomplanatusfrom its adulterants by using ITS sequences.Methods：10 samples of the differentA.complanatusand 2 samples of original plant，3 samples ofA.dahuricus，4 samples of theA.membranaceusvar.mongholicus，3 samples ofA.adsurgens，1 sample of theCrotalariapallidaandC.retusawere collected.ITS sequence was amplified by PCR and sequenced unidirectionally.The interspecific genetic distances among 6 species ofA.complanatusand its adulterants were calculated，and NJ tree and UPGMA tree were constructed by MEGA 5.Among them，A.membranaceusvar.mongholicusandA.dahuricusinterspecific K-2-P minimum distance was 0.080 2，and then followed byA.membranaceusvar.mongholicus.A.adsurgensinterspecific was 0.082 4，C.pallidaandC.retusainterspecific was 0.236 2 and 0.229 9，respectively.In addition，A.complanatusintraspecific genetic distance was 0.003 0 computed by MEGA 5.0.Accoding to determination ofA.complanatusadulterants，it showed thatA.membranaceusvar.mongholicusandA.dahuricusinterspecific K-2-P minimum distance was 0.000 9 andC.pallidawas 0.236 2.Results：ITS sequences were obtained from 24 samples respectively，there wereA.complanatus644-688 bp，A.membranaceusvar.mongholicus664-673 bp，A.adsurgens685-687 bp，A.dahuricus676-688 bp，C.pallida785 bp andC.retusa837 bp.Phylogeny tree reconstruction using NJ and UPGMA analysis based on ITS nucleotide sequences can effectively distinguishA.complanatusfrom adulterants.Conclusion：ITS sequences can be used to identifyA.complanatusfrom its adulterants successfully and is an efficient molecular marker for authentication ofA.complanatusand its adulterants.

Astragaluscomplanatus；ITS sequences；molecular identification

2015-03-25)

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAI28B02)；包頭市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013X2001)；中醫(yī)藥行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201407003)

*

李旻輝，教授，研究方向：中藥資源、蒙藥研究；Tel：(0472)7167739，E-mail：li_minhui@aliyun.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.7.006