鄭婷婷，魏偉淋，楊向暉，林順權(quán)(.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，廣東 廣州 50642；2.上饒市森林資源監(jiān)測中心，江西 上饒 334000)

基于枇杷轉(zhuǎn)錄組序列的SSR分子標(biāo)記引物開發(fā)

鄭婷婷1,2，魏偉淋1，楊向暉1，林順權(quán)1
(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.上饒市森林資源監(jiān)測中心，江西 上饒 334000)

為獲得更多的枇杷SSR引物，對枇杷轉(zhuǎn)錄組測序得到的1 kb以上的11 798條Unigenes進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索。結(jié)果在3515 條Unigenes（6.77%）中共獲得4438個SSR位點(diǎn)，其中主要重復(fù)類型為雙堿基重復(fù)和三堿基重復(fù)，二者占SSR總數(shù)的68.27%，而四、五、六堿基重復(fù)類型較少，僅占1.42%。對選出的SSR標(biāo)記采用Primer3進(jìn)行引物設(shè)計，得到7911 對SSR位點(diǎn)特異引物，可用于枇杷遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助育種、育種群體的建立等研究。

枇杷；轉(zhuǎn)錄組；SSR

DNA分子標(biāo)記是鑒定種質(zhì)資源遺傳多樣性的重要手段，也是一種重要的輔助育種方法[1]。簡單重復(fù)序列(Simple sequence repeats, SSR)又稱微衛(wèi)星DNA、短串聯(lián)重復(fù)序列，一般以1～6個堿基為核心序列。研究表明，基因組中平均每50 kb就有1個SSR[2—3]。SSR標(biāo)記主要包括基因組SSR和表達(dá)序列標(biāo)簽SSR兩種類型。SSR標(biāo)記是共顯性標(biāo)記，具有重復(fù)性好、易操作、覆蓋面廣等優(yōu)點(diǎn)，且與其他標(biāo)記相比常表現(xiàn)出較高的多態(tài)性[4—5]。引物開發(fā)是利用SSR標(biāo)記的前提。傳統(tǒng)的SSR引物標(biāo)記開發(fā)方法費(fèi)時費(fèi)力，陽性克隆率低，成功機(jī)率小[6—8]，因此 SSR標(biāo)記開發(fā)受到很大限制，通常只能利用近緣物種的相關(guān)信息進(jìn)行分析篩選。隨著轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的日益成熟，基于現(xiàn)有轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫信息進(jìn)行SSR引物開發(fā)將是一種既經(jīng)濟(jì)又有效的方法。Denovo轉(zhuǎn)錄組測序可以在物種基因組未知的情況下產(chǎn)生大量含有SSR的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)，為物種的遺傳分析提供強(qiáng)大支撐[9—11]。

目前關(guān)于枇杷Eriobotrya japonica成功開發(fā)SSR標(biāo)記的報道還較少，其SSR引物數(shù)量偏少[12—13]，標(biāo)記仍更多使用蘋果屬M(fèi)alus和梨屬Pylus的SSR引物[14]，這在很大程度上限制了枇杷SSR標(biāo)記的開發(fā)和利用。為進(jìn)一步挖掘枇杷SSR位點(diǎn)，本研究分析了枇杷轉(zhuǎn)錄組中的SSR位點(diǎn)，開發(fā)出大批量SSR引物，為最終找到適用于枇杷SSR標(biāo)記研究的引物提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

試材為枇杷品種‘黃金塊’、‘解放鐘’和‘白玉’果實(shí)轉(zhuǎn)色期果肉，采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院枇杷屬植物種質(zhì)資源圃。材料用液氮速凍后送百邁客生物科技有限公司(北京)測序，共包含51 934條Unigenes。

1.2轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)檢索

利用MISA(Microsatellite identification tool)程序?qū)﹁凌似唇有蛄羞M(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索。MISA是一款鑒定SSR的軟件，可通過對Unigene序列的分析，鑒定出6種類型的SSR：單堿基(Mono-nucleotide)重復(fù) SSR、雙堿基(Di-nucleotide)重復(fù)SSR、三堿基(Tri-nucleotide)重復(fù) SSR、四堿基(Tetra-nucleotide)重復(fù)SSR、五堿基(Penta-nucleotide)重復(fù)SSR和六堿基(Hexa-nucleotide)重復(fù)SSR。

2　結(jié)果與分析

2.1枇杷轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)的分布特點(diǎn)

在枇杷轉(zhuǎn)錄組的51 934條Unigenes中，利用MISA軟件對篩選得到的1 kb以上的11 798條Unigene進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索，共檢測到4438個SSR位點(diǎn)。這些SSR分布在3515條序列上，發(fā)生頻率(含有SSR的Unigene數(shù)量與總Unigene數(shù)量之比)為6.77%。其中，超過1個SSR位點(diǎn)的共745條(16.79%)，復(fù)合SSRs約260條(5.86%)。單堿基重復(fù)SSR共1345條(30.31%)，雙堿基重復(fù)SSR共2051條(46.21%)，三堿基重復(fù)SSR共979條(22.06%)，四、五、六堿基重復(fù)SSR總數(shù)為63條(1.42%)(表1)。SSR的分布頻率(SSR數(shù)與Unigene總數(shù)之比)為 8.55%。

2.2枇杷轉(zhuǎn)錄組SSR分布特征

從表2可以看出，枇杷轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)單元主要以10次和6次重復(fù)為主，分別為889個(20.03%) 和823個(18.54%)；其次為5次和7次重復(fù)，分別為671個(15.12%)和469個(10.57%)；其余都占SSR總數(shù)的10%以下；20次以上的重復(fù)最少，僅45個，且以單堿基重復(fù)為主，占1.01%(表2)。表3為SSR不同基序長度的具體基序序列分布。其中單堿基重復(fù) SSR共有4種類型(30.31%)，其中以 A/T為主(97.99%)。雙堿基重復(fù)SSR共有8種類型(46.21%)，以AG/CT為主要類型(88.59%)。三堿基重復(fù)SSR共有20種類型(22.06%)，大部分類型為AAG/CTT(21.96%)。四堿基重復(fù)SSR共有40種類型(1.10%)，其中以AAAT/ATTT為主(16.33%)。五堿基重復(fù)SSR共有18種類型(0.20%)，六堿基重復(fù)SSR共有10種類型(0.11%)，五、六堿基重復(fù)SSR類型的數(shù)量均較少。

表1　SSR分析結(jié)果Table 1　The results of SSR analysis

表2　枇杷轉(zhuǎn)錄組SSR不同基序長度和重復(fù)次數(shù)的數(shù)量分布Table2　Distribution of the SSR motifs and its times of repetition in loquat transcriptome

表3　SSR基序類型分布Table 3　Distribution of the SSR motifs

2.3枇杷轉(zhuǎn)錄組SSR平均分布距離及引物設(shè)計

枇杷轉(zhuǎn)錄組SSR出現(xiàn)的頻率較高，重復(fù)單元的類型較豐富。從枇杷轉(zhuǎn)錄組51 934條Unigenes中篩選出11 798條大于1 kb的Unigene進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索，共獲得4438個SSR位點(diǎn)，這些SSR位點(diǎn)分布在3515條序列上，平均分布距離5.52 kb，出現(xiàn)頻率6.77%。對找出的SSR標(biāo)記采用Primer3進(jìn)行引物設(shè)計，得到7911對SSR位點(diǎn)特異引物。表4為設(shè)計得到的部分引物序列。

表4　部分SSR重復(fù)類型及引物序列Table 4　Some SSR repeat types and primer sequences

3　討論

選擇合適的遺傳分析工具對遺傳學(xué)背景研究尤為重要。在分子標(biāo)記中，RAPD操作簡單，但重復(fù)性差；AFLP穩(wěn)定可靠，但成本高，對DNA質(zhì)量要求高，且實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜、工作量大。相比而言，SSR標(biāo)記具有共顯性、高度可重復(fù)、多態(tài)性豐富、對DNA質(zhì)量要求低、可PCR快速檢測等優(yōu)點(diǎn)，是遺傳學(xué)背景研究非常有效的工具，其不足是開發(fā)引物有一定的難度。

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，EST數(shù)據(jù)不斷增加，使得EST-SSR標(biāo)記將更加豐富。基于轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫或者EST數(shù)據(jù)庫開發(fā)SSR標(biāo)記在辣椒Capsicum annuum[15]、荔枝Litchi chinensis[16]、柑橘Citrus clementina[17]、桃Amygdalus persica[18]等植物中均有報道，并廣泛應(yīng)用于品種鑒定及改良、資源分析、遺傳圖譜構(gòu)建、功能基因發(fā)掘等方面。

目前，枇杷可以利用的SSR標(biāo)記數(shù)量還較少，SSR分子標(biāo)記在枇把屬植物中的研究應(yīng)用主要是利用蘋果屬植物的SSR引物進(jìn)行分析[19—20]。本研究對枇杷轉(zhuǎn)錄組測序得到的1 kb以上的11 798條Unigene進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索，共獲得4438個SSR位點(diǎn)，其中主要重復(fù)類型為雙堿基重復(fù)和三堿基重復(fù)，二者占SSR總數(shù)的68.27%，而四、五、六堿基重復(fù)類型較少，僅占1.42%。這與大多數(shù)植物的SSR主要以二、三堿基重復(fù)為主是一致的。枇杷SSR位點(diǎn)的平均分布距離為5.52 kb，與已知的木本植物SSR分布距離相比，屬于較高類型，高于楊樹Populus spp.(14.0 kb)[21]、銀杏Ginkgo biloba (12.02 kb)[22]、北美鵝掌楸Liriodendron tulipifera(8.5 kb)[23]、柑Citrus(5.7 kb)[24]，略低于橡膠樹Hevea brasiliensis (3.93 kb)[25]和茶樹Camellia sinensis(3.68 kb)[26]等木本植物。對找出的SSR標(biāo)記采用Primer3進(jìn)行引物設(shè)計得到的7911 對SSR位點(diǎn)特異引物能否在枇杷中進(jìn)行應(yīng)用，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。從文獻(xiàn)報道來看，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得的 SSR引物，其多態(tài)性較高，如辣椒[15](36.84%)、菠菜 Spinacia oler acea[27](32.56%)、野三七Panax vietnamensis var. fuscidiscus[28](50.00%)、杜仲Eucommia ulmoides[29](23.53%)。由此可推測，利用枇杷轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得的SSR引物，也可用于枇杷遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助育種、育種群體建立等方面的研究。

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Development of SSR Molecular Markers Based on Transcriptome Sequencing of Eriobotrya japonica

ZHENG Ting-ting1,2, WEI Wei-lin1, YANG Xiang-hui1, LIN Shun-quan1
(1.College of Horticulture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong China; 2.Shangrao City Forest
Resources Monitoring Center, Shangrao 334000, Jiangxi China)

In order to obtain more loquat SSR primers, the SSR locis were analyzed using microsatellite locus scan tool (SSRIT) to analyze 11 798 unigenes (>1 kb) based on the transcriptome sequencing data from flesh of loquat, and we screened out 4438 SSR locis which distributed in 3515 unigenes, accounting for 6.77% of the unigenes. The di-nucleotide and tri-nucleotide repeats were the most abundant repeat types, accounting for 68.27% of the total number of SSRs. And the tetra-nucleotide, penta-nucleotide and hexa-nucleotide repeats were the minor repeat types, accounting for only 1.42%. There were 7911 primers obtained through Primers3 software, which had an important application value to analyze genetic diversity, molecular assistant breeding and establishment of breeding population of loquat.

Eriobotrya japonica; transcriptome; SSR

10.3969/j.issn.1009-7791.2015.04.002

S667.3

A

1009-7791(2015)04-0274-05

2015-10-20

廣州市科技計劃項(xiàng)目(201504010028)

鄭婷婷，碩士，從事果樹育種及生物技術(shù)研究。E-mail: hygl2012@163.com

注：楊向暉和林順權(quán)為通訊作者。E-mail: gzyxh@scau.edu.cn; loquat@scau.edu.cn