陳 禮 鄭小林 胡 寧 楊 軍 羅洪艷 姜 帆 廖彥劍

(重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，視覺損傷與再生修復(fù)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400030)

1 引言

細(xì)胞分離作為一個(gè)重要的純化過程［1］，在生物研究和分析診斷中有著極其重要的應(yīng)用。許多基于細(xì)胞的研究領(lǐng)域，如臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品加工以及制藥工業(yè)等都需要進(jìn)行目標(biāo)細(xì)胞的高靈敏度檢測和高純度加工，上述基礎(chǔ)及應(yīng)用研究工作的開展都依賴于細(xì)胞分離技術(shù)［2～5］。針對懸浮液中生物微粒的電磁操作是目前生物分析領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)，細(xì)胞分離也是其中一個(gè)重要內(nèi)容。

傳統(tǒng)的細(xì)胞分離方法主要分為兩類［6］:第一類是依靠細(xì)胞本身的尺寸、重力特性進(jìn)行分離，如離心法、重力沉積法等，這類方法分離精度較低，分離時(shí)間較長且操作復(fù)雜，對細(xì)胞活性有較大影響;第二類則需要細(xì)胞間接帶電或者外加磁性物質(zhì)，最后在電場或者磁場作用下進(jìn)行細(xì)胞分離，如電泳法、磁性分離法等，這類方法通常需要對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，在細(xì)胞表面附著其它物質(zhì)，且在分離之后難以去除附著物，對于細(xì)胞存活率影響較大，操作流程繁瑣，價(jià)格不菲。同時(shí)，上述細(xì)胞分離方法通常需要旋流器、流式細(xì)胞儀等專業(yè)設(shè)備，存在體積大、操作人員需進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)、成本昂貴等缺點(diǎn)，限制了其廣泛應(yīng)用。

由電泳技術(shù)發(fā)展而來的介電電泳(Dielectrophoresis，DEP)［7］打破了前者要求微粒帶電的限制，能讓電中性微粒在空間非均勻直流或者交流電場的作用下，發(fā)生極化而沿場強(qiáng)變化方向受到介電電泳力(凈力)，并在介電電泳力作用下發(fā)生移動。自1978年P(guān)ohl［8］將介電電泳引入生物和化學(xué)領(lǐng)域，特別是將該技術(shù)應(yīng)用于傳統(tǒng)電泳無法高效解決的細(xì)胞分離和操縱難題以來，該技術(shù)就一直受到各國研究者的重視并不斷發(fā)展完善［9］。較傳統(tǒng)電泳方法而言，該技術(shù)具有許多優(yōu)點(diǎn)［10～12］，如不需要標(biāo)記抗體，從而可避免細(xì)胞在分離過程中因抗體反應(yīng)而發(fā)生生物性質(zhì)改變;所用低強(qiáng)度的交變電場對細(xì)胞的作用是“非破壞性”的，大量研究結(jié)果已經(jīng)證明其不會改變細(xì)胞的生長及分裂性質(zhì);使用靈活，電場強(qiáng)度、頻率、相位都容易調(diào)控，便于自動化操作;同時(shí)，介電電泳分離方法還可與其它方法結(jié)合使用，以達(dá)到最佳的細(xì)胞分離檢測效果。

近年來，隨著介電電泳技術(shù)的理論成熟和微流控芯片加工技術(shù)的飛速發(fā)展，利用微流控芯片體積小、造價(jià)低廉、液體流動可控、消耗試樣和試劑極少、通量高、檢測分析精度好等優(yōu)點(diǎn)，在芯片上開展基于介電電泳的細(xì)胞分離成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)［13～16］?；诮殡婋娪镜奈⒘骺丶?xì)胞分離芯片結(jié)合了介電電泳和微流控芯片技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)，分離目標(biāo)不僅局限于細(xì)胞，也可以進(jìn)行微米尺度的礦物顆粒［17］、聚苯乙烯微球［18］、液滴［19］、細(xì)菌［20～21］和酵母菌［22］等目標(biāo)物的分離純化，甚至還可以分離納米尺度的病毒［23］、納米粒子、DNA［24］、碳納米管［25～26］等。

本文介紹基于介電電泳的微流控細(xì)胞分離芯片的研究現(xiàn)狀，總結(jié)了影響介電電泳分離的關(guān)鍵因素，對不同類型的微流控細(xì)胞分離芯片進(jìn)行了介紹，并對該技術(shù)的未來發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望。

2 介電電泳細(xì)胞分離的基本理論

帶電粒子在直流電場作用下于一定介質(zhì)中所發(fā)生的定向運(yùn)動，稱為電泳;非帶電顆粒(電介質(zhì))在電場作用下的定向運(yùn)動叫電介質(zhì)電泳(Dielectrophoresis，DEP)，簡稱“介電電泳”［27］。電泳和介電電泳有著本質(zhì)的區(qū)別。電泳的粒子帶電，而介電電泳的顆粒為電中性。懸浮于鹽溶液中的細(xì)胞可以在電場中運(yùn)動，這是因?yàn)榧?xì)胞表面具有一定的電荷(通常為負(fù)電荷)，可以吸附被極化的水分子層，它與介質(zhì)之間存在著電位差，此電位差產(chǎn)生了細(xì)胞電泳運(yùn)動的驅(qū)動力。電中性顆粒(例如細(xì)胞)處于非均勻電場時(shí)，電介質(zhì)顆粒中的電荷在電場極化作用下發(fā)生移動從而構(gòu)成一個(gè)電偶極子，該細(xì)胞電偶極子在電場中受到電場力的作用。該電場力即為介電電泳力，簡稱DEP力［28，29］。

當(dāng)微粒和溶液處于交流電場中時(shí)，微粒和溶液都會受到極化作用，當(dāng)微粒比溶液受到的極化作用強(qiáng)時(shí)，微粒受到的沿場強(qiáng)增大方向的力大于溶液，從而使中性微粒聚集在電場的極大值處，這一現(xiàn)象稱為正介電電泳，所受的力為正介電電泳力，簡稱pDEP力;反之則為負(fù)介電電泳，所受的力為負(fù)介電電泳力，簡稱 nDEP 力［30］。

對球形顆?；蛘咔蛐渭?xì)胞(半徑為r，相對介電常數(shù)為εP，電導(dǎo)率為σp)懸浮于流體介質(zhì)(相對介電常數(shù)為εf，電導(dǎo)率為σf)的情形，處于外加非均勻交變電場中且電場的相位不發(fā)生變化時(shí)，根據(jù)偶極子模型可以得到作用在其上的DEP力(FDEP)，其簡化計(jì)算公式［31，32］為:

式中:ε0為真空介電常數(shù);ω為外加電場信號的角頻率;Erms為外加電場的均方根。DEP力的方向取決于K*(ω)實(shí)部部分(Clausius-Mossotti因子，簡稱CM因子，用fCM(ω)表示)的符號。當(dāng)Re［K*(ω)］＞0時(shí)，顆粒在非均勻外加電場的作用下從低電場區(qū)域被吸引至高電場區(qū)域，為正介電電泳(pDEP);反之，當(dāng)Re［K*(ω)］＜0時(shí)，將從高電場區(qū)域被排斥至低電場區(qū)域，則為負(fù)介電電泳(nDEP)。式(1)所示DEP力(FDEP)的計(jì)算有一個(gè)前提，那就是施加的非均勻交變電場的相位不發(fā)生變化。當(dāng)相位發(fā)生變化的時(shí)候，式(1)就不再適用了，此時(shí)的介電電泳力與K*(ω)的虛部部分有關(guān)，計(jì)算較為復(fù)雜，稱為行波DEP［33，34］。

細(xì)胞在介電電泳力作用下可改變其運(yùn)動狀態(tài)或趨勢，進(jìn)而可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞操作。根據(jù)細(xì)胞在緩沖液中所受介電電泳力的差異，可以進(jìn)行細(xì)胞的分離。通常情況下，在分離樣本和緩沖液環(huán)境固定后，CM因子只與電場信號頻率有關(guān)，因此在實(shí)驗(yàn)中CM因子-頻率圖譜是選定合適的介電電泳分離頻段的重要依據(jù)［35］。要分離兩種不同細(xì)胞的混合樣品，可以借助介電電泳力的差異設(shè)計(jì)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方案。目前經(jīng)典的方案有兩種:(1)使一種細(xì)胞的CM因子為正值，受到正介電電泳作用，運(yùn)動方向?yàn)榭拷姌O方向(高電場區(qū)域)，另一種細(xì)胞的CM因子為負(fù)值，受到負(fù)介電電泳作用，運(yùn)動方向?yàn)檫h(yuǎn)離電極方向(低電場區(qū)域);(2)兩種細(xì)胞受到同一類型介電電泳力時(shí)(pDEP或nDEP)，借助介電電泳力大小的差異實(shí)現(xiàn)樣本在芯片內(nèi)部運(yùn)動軌跡差異達(dá)到分離的目的。

3 不同類型的微流控細(xì)胞/微粒分離芯片

由公式(1)可知，影響細(xì)胞DEP作用的因素有細(xì)胞尺寸、細(xì)胞和懸浮液的相對介電常數(shù)和電導(dǎo)率、電場梯度的大小、電信號頻率等。其中，電場梯度的產(chǎn)生主要取決于電極形狀，因而電極形狀的選擇對介電電泳細(xì)胞分離芯片的設(shè)計(jì)非常重要［36，37］;而外加信號的類型將直接影響分離操作，因此激勵信號的優(yōu)化配置顯得尤為關(guān)鍵。此外，選擇合適的懸浮液也是必須考慮的因素。

3.1 基于細(xì)胞尺度效應(yīng)的介電電泳分離芯片

細(xì)胞的尺寸從幾微米到幾十乃至上百微米，對于不同尺寸的細(xì)胞，在非均勻電場中，所受到的介電電泳力FDEP與細(xì)胞半徑r的三次方成正比，因此可以利用此原理進(jìn)行細(xì)胞分離。下面介紹幾種利用此類方法進(jìn)行分離的微流控芯片。

3.1.1 DEP與Field-Flow-Fractionation(FFF)聯(lián)用法分離芯片 根據(jù)層流理論，在微管道中流動的液體流層與管壁、流層與流層之間的粘性力導(dǎo)致管壁處流層流速最低，管軸處速度最大，且越靠近管軸處速度越大，速度與管軸處的距離成拋物線分布。Wang等［38，39］發(fā)展了基于DEP力場的流動分離方法(圖1)，當(dāng)流場以圖示方向流動時(shí)，電極陣列置于流道的底部，形成非均勻電場，通過選擇合適的頻率使細(xì)胞受nDEP力作用，而nDEP力將把顆粒推離流道底部;顆粒最終的位置取決于DEP力在垂直方向上的分量FDEPz與顆粒重力及浮力合力Fsed的平衡關(guān)系。由于DEP力與顆粒半徑成正比，不同尺度的顆粒將承受不同的DEP力，它們在垂直方向的平衡位置(h1和h2)也會同。不同的顆粒將分別處于拋物線速度剖面的不同層，由此具有不同的移動速度(v1與v2)。當(dāng)在管內(nèi)流動一段時(shí)間和距離之后，各尺寸不同的粒子就會在距離上產(chǎn)生差異，此時(shí)在管口分時(shí)收集就可達(dá)到分離不同種細(xì)胞或者微粒的目的。

圖 1 DEP-FFF 細(xì)胞分離微流控芯片［38，39］Fig.1 Dielectrophoresis-field-flow-fractionation(DEP-FFF)cell separation microfluidic chip

3.1.2 DEP與曲率誘導(dǎo)聯(lián)用法分離芯片 Zhu等［40］在2011年提出了一種介電電泳細(xì)胞分離芯片。該芯片在蛇形通道內(nèi)使用曲率誘導(dǎo)介電電泳，成功地用于分離酵母菌和3 μm尺寸的聚苯乙烯顆粒(圖2)，分離效率高達(dá)95%。該芯片由4個(gè)流通池和連接流通池的蛇形分離通道構(gòu)成(圖2a)。其工作原理如圖2b所示:混合樣品(顆粒)從A口流入，B口流入緩沖液。當(dāng)混合微粒運(yùn)動到轉(zhuǎn)彎位置的時(shí)候，選擇合適的頻率使白色顆粒CM因子為負(fù)，藍(lán)色顆粒CM因子為正，這樣在轉(zhuǎn)彎時(shí)藍(lán)色顆粒由pDEP產(chǎn)生的向心力繼續(xù)留在內(nèi)側(cè)流層中，而白色顆粒受到nDEP作用向外側(cè)流層偏移，這樣經(jīng)過數(shù)十個(gè)蛇形轉(zhuǎn)彎通道的曲率誘導(dǎo)介電電泳作用積累，使白色顆粒在外側(cè)流層中，藍(lán)色顆粒留在內(nèi)側(cè)流層。在出口處，在外側(cè)流層中的白色顆粒從C口流出，在內(nèi)側(cè)流層中的藍(lán)色顆粒從D口流出，達(dá)到分離的目的。研究人員借助Comsol模擬(圖2c和2d)其分離過程，結(jié)果顯示，借助曲率誘導(dǎo)介電電泳效應(yīng)，能夠?qū)?xì)胞尺寸不一和CM因子不同的兩種細(xì)胞進(jìn)行分離。

該類分離芯片可用于對介電電泳極性相反(一種為pDEP，另一種為nDEP)的細(xì)胞進(jìn)行分離，分離精度較高，操作簡便，但缺點(diǎn)是只能分離兩種細(xì)胞或者微粒，且需實(shí)驗(yàn)前需測得兩種細(xì)胞或者微粒的正-負(fù)介電電泳臨界頻率。

細(xì)胞半徑是標(biāo)志細(xì)胞大小的參數(shù)，常用作細(xì)胞分選的特征參數(shù)。介電電泳力FDEP與細(xì)胞半徑r的三次方成正比，使得基于介電電泳和細(xì)胞尺寸差異的分離方法更容易得以實(shí)現(xiàn)。與尺寸相關(guān)的DEP分離方法也常與其它方法聯(lián)合使用，如DEP與超聲聯(lián)用、DEP與磁場聯(lián)用、DEP與光鑷技術(shù)聯(lián)用等［31，32］，在此就不一闡述。此外，基于細(xì)胞尺度效應(yīng)的介電電泳分離芯片在某些方面亟需改進(jìn):(1)在理論和仿真研究中，細(xì)胞模型的建立還有待進(jìn)一步完善。由于大多數(shù)細(xì)胞是球型，因此在進(jìn)行理論仿真時(shí)候常把細(xì)胞看作是雙層球殼，但事實(shí)上很多細(xì)胞是長條狀、棒狀或者其它不規(guī)則形狀。(2)在實(shí)際樣本中，細(xì)胞(粒子)間的區(qū)別低于實(shí)驗(yàn)中選取的特定樣本，也就是說，當(dāng)兩種細(xì)胞在尺寸、形狀上具有一定的相似性時(shí)，對于這類性質(zhì)差別不大的分離對象，還需進(jìn)一步提高介電電泳的分辨率。而且，對于植物細(xì)胞而言，細(xì)胞壁的存在也會使細(xì)胞理論模型和實(shí)際情況有所區(qū)別。

圖2 曲率誘導(dǎo)介電電泳細(xì)胞分離芯片［40］(a)芯片實(shí)物圖;(b)原理圖;(c)芯片入口流路分布圖;(d)芯片出口流路分布圖。Fig.2 Cell separation microfluidic chip via curvature-induced dielectrophoresis:(a)Picture of microfluidic chip;(b)Illustration of sheath-flow focusing and dielectrophoretic separation of particles;(c)and(d)Numerical prediction of the flow of inlet and outlet［40］

3.2 基于電極優(yōu)化的介電電泳分離芯片

在基于介電電泳的細(xì)胞分離研究中，電場梯度同樣是影響細(xì)胞DEP作用的重要因素。微流控芯片上的非均勻電場主要是由電極產(chǎn)生的，所以電極的形狀和分布對FDEP的分布具有決定意義［41］。芯片電極的分類方法比較多，沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。如按照電極形狀可分為叉指電極、城墻狀電極、螺旋電極、對電極等;按照電極的分布可分為底部電極、側(cè)壁電極、和空間電極等，其中側(cè)壁電極還可分為單側(cè)電極、雙側(cè)電極等;按照電極的材質(zhì)和制作工藝可分為金屬電極、碳電極、復(fù)合電極等;按照電極的配置方式可分為二維平面電極、三維立體電極等。本文將按照電極的結(jié)構(gòu)將電極分為陣列式電極、環(huán)狀電極、柱狀電極和不規(guī)則電極等類型。

3.2.1 陣列式電極 陣列電極分離芯片的設(shè)計(jì)思路是通過在微流控芯片上集成陣列化微電極(不同或同種結(jié)構(gòu))，實(shí)現(xiàn)大量生化樣品的在線分離和富集。電極的形狀、大小和位置直接影響非均勻電場的分布，而電極的厚度則影響芯片的鍵合和系統(tǒng)的集成化。Yang等［42］對平面交錯(cuò)式陣列電極設(shè)計(jì)的DEP芯片(圖3a)采用多物理量耦合分析軟件(FEMLAB)進(jìn)行仿真，計(jì)算了圖3b中右上角所示電極結(jié)構(gòu)的電場分布。電極陣列中高電場區(qū)域始終位于電極邊緣處，該處適合做正介電電泳運(yùn)動的細(xì)胞實(shí)現(xiàn)富集。在電極的寬度和間距相等時(shí)，低電場區(qū)域出現(xiàn)在電極的中心位置和相鄰電極的中心線位置，且場強(qiáng)相等;如果電極的寬度大于電極的間距，則低電場區(qū)域集中于電極平面的中心線位置;如果電極的寬度小于電極的間距，則低電場區(qū)域集中于相鄰電極間距的中心線位置，在該處適合作負(fù)向介電電泳的細(xì)胞實(shí)現(xiàn)富集。Yang等［42］設(shè)計(jì)的芯片管道高度不到100 m，在2 V和2 MHz的電信號條件下，能夠保證99%的捕獲效率，從而實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞的正介電電泳分離和富集。

陣列式電極以其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，具有很多優(yōu)點(diǎn):可在有限的區(qū)域內(nèi)分列排布大量電極;適用于高通量的分析檢測要求，分離效率高且速度快。但陣列式電極對電極加工工藝和流程要求較高，電極間隙和相鄰電極間的距離有較為嚴(yán)格的要求，在設(shè)計(jì)芯片時(shí)，應(yīng)先根據(jù)適用對象和目標(biāo)使用數(shù)值模擬軟件得到其最佳的物理分布位置［43］。

3.2.2 環(huán)狀電極 隨著介電電泳技術(shù)的發(fā)展，單純的針狀或者對狀電極已經(jīng)不能滿足實(shí)驗(yàn)的需要。而且，隨著分離的細(xì)胞種類多樣化，對電場梯度的要求也越來越高。因此，一些新型電極，如環(huán)狀電極被設(shè)計(jì)出來(圖4)［44，45］。環(huán)狀電極的特點(diǎn)在于其電極形狀不是傳統(tǒng)的城墻形狀或者叉指形狀，而是根據(jù)實(shí)驗(yàn)對象靈活多變，大多比較復(fù)雜，電極曲線比較光滑，如常見的螺旋電極。

3.2.3 柱狀電極 在介電電泳分離芯片中，常用的二維電極具有許多局限性，而且加工工藝復(fù)雜。傳統(tǒng)芯片微電極是厚度為幾百納米的金屬薄膜平面電極，其加工方法是在采用電鍍或?yàn)R射的方法在基片上形成特定圖案的金屬電極，對于過量的部分利用剝離、蝕刻，結(jié)合某些特殊的光刻加工工藝去除［46］。但二維電極產(chǎn)生的電場隨著粒子距電極表面距離的增加而呈指數(shù)型衰減［47］，這意味著部分粒子由于距離電極較遠(yuǎn)，受到電場的作用微弱，而無法實(shí)現(xiàn)有效控制。

為了解決上述問題，近年來越來越多的芯片采用雙側(cè)平面電極或三維電極來產(chǎn)生三維電場。與二維電極相比，三維電極的魯棒性更好，可承受的電流密度更大，且在電流熱效應(yīng)作用下產(chǎn)生的焦耳熱較平面電極小，在平面電極發(fā)展的同時(shí)，三維電極以其空間的電場分布優(yōu)勢，需要電壓小且捕捉更牢靠的優(yōu)勢吸引了人們的視線［48］。三維電極中常采用柱狀電極，其使用頻率較高，加工難度較小，分離效果較好。

圖3 陣列式電極［42］Fig.3 Array of electrodes［42］a.電極結(jié)構(gòu)(Electrode structure);b.電場仿真(Simulation of field)。

圖 4 環(huán)狀電極［44，45］Fig.4 Ringlike electrodes［44，45］(a)螺旋電極(Picture of spiral electrodes);(b)同心環(huán)電極(Picture of concentric electrodes)。

Hunt等［49］設(shè)計(jì)并制作了圓柱狀電極微流控芯片(圖5a)，每個(gè)柱狀電極由單獨(dú)的引線供電，故可在同一芯片區(qū)域選擇不同幅值、頻率和相位的信號配合使用，使該電場區(qū)域適合進(jìn)行介電電泳分離活動。

Iliescu等［50］設(shè)計(jì)并制作了三維正方體柱狀電極細(xì)胞分離微流控芯片(圖5b)，與Hunt等的圓柱形電極［49］相比，此電極截面為正方形，通過數(shù)值仿真可以看出正方形的4個(gè)頂點(diǎn)處電場梯度值最高，在介電電泳作用下，細(xì)胞吸附能力最強(qiáng)，較圓柱形電極的分離、富集效果更好，將其用于分離活、死酵母細(xì)胞的分離精度95%。

圖 5 三維電極［49，50］Fig.5 Three-dimensional(3D)electrodes［49，50］(a)圓柱狀電極(Picture of columnar electrodes);(b)正方體柱狀電極、電場仿真圖(Picture and the numerical simulation of electric field of the cubic electrode)。

當(dāng)然，柱狀電極只是三維電極的一個(gè)典型代表，三維電極作為近幾年來熱門的研究話題，其發(fā)展速度也是日新月異，各種形狀、各種材質(zhì)的三維電極已經(jīng)多次報(bào)道。

3.2.4 不規(guī)則電極 在介電電泳分離技術(shù)中，電極的設(shè)計(jì)占據(jù)了相對重要的地位。

由于分離目標(biāo)的多樣化，導(dǎo)致了電極形狀和結(jié)構(gòu)的多樣化。除了前面介紹的幾種常規(guī)電極，很多非常規(guī)的不規(guī)則電極也在使用。Hoettges等［51］發(fā)展了拉鏈狀環(huán)形電極(圖6a)，并使用其進(jìn)行了孢子的富集和分離，實(shí)驗(yàn)觀察到孢子聚集在拉練環(huán)狀的中心處，在該裝置中，孢子受到nDEP作用。Malnar等［52］設(shè)計(jì)的條狀電極尖端有三角形彎折(圖6b)，使得一種微粒被捕捉在電極處，而另一種微粒隨著流體的拖曳力流出。Gonzalez［53］設(shè)計(jì)了可分別加信號的棘齒狀電極(圖6c)，成功進(jìn)行了鐵磁礦物粒子和聚苯乙烯顆粒的捕捉和分離，分離效率高。Pethig等［54］設(shè)計(jì)了波浪形電極陣列，利用多重介電電泳和行波介電電泳的重疊，使得微粒達(dá)到分離目的(圖6d)。除了上述不同電極形狀之外，還有糖葫蘆狀、叉指電極等各式電極，其設(shè)計(jì)思路與分離對象也各不相同。

圖6 各種不規(guī)則電極Fig.6 Different kinds of irregular electrodes(a) 拉鏈環(huán)狀電極(Zipper annular electrodes)［51］;(b) 彎折三角形電極(Bending triangle electrodes)［52］;(c) 棘齒狀電極(Ratchet electrodes)［53］;(d) 波浪形電極(Undulating electrodes)［54］。

以上分類是從電極形狀上考慮的，不能包含所有報(bào)道過的微電極，這是因?yàn)殡姌O分類方法較多，分類標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一。在考慮芯片上微電極的設(shè)計(jì)時(shí)候，應(yīng)當(dāng)從實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)對象出發(fā)，綜合電極形狀、電極厚度、加工難度以及組裝集成的難度等方面來考慮。二維平面電極已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種微流控芯片中，最近幾年三維電極以其獨(dú)特的空間電場分布優(yōu)勢正在逐漸擴(kuò)展到微流控芯片的各個(gè)領(lǐng)域，是微電極發(fā)展的主要方向與趨勢之一。

3.3 基于激勵信號優(yōu)化的介電電泳分離芯片

根據(jù)所施加的外加電場的種類不同，可以將介電電泳分離芯片分為直流式介電電泳芯片(DC-DEP Chip)、交流式介電電泳芯片(AC-DEP Chip)，而交流式介電電泳芯片還可細(xì)分為常規(guī)介電電泳芯片、行波介電電泳芯片。

3.3.1 直流式－介電電泳芯片(DC-DEP Chip) 根據(jù)介電電泳的定義，當(dāng)細(xì)胞處于非均勻直流電場中時(shí)，也會發(fā)生極化現(xiàn)象，產(chǎn)生介電電泳力。直流式-介電電泳芯片模式中，直流信號施加在介電電泳芯片微通道兩端，利用微通道內(nèi)加工的絕緣障礙可以使電力線發(fā)生扭曲，從而產(chǎn)生非均勻電場，進(jìn)而產(chǎn)生極化現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)樣品的介電電泳富集、分離操控。Blanca和Cummings研究小組證明了集成圓形絕緣微柱陣列的介電電泳芯片對分散性微粒和聚苯乙烯的介電電泳誘捕能力［55，56］。Ciprian等［57］采用相同的集成有圓形絕緣微柱陣列的介電電泳芯片實(shí)現(xiàn)了酵母細(xì)胞的介電電泳富集，其富集效率達(dá)到75%。魏慶華等［58］采用SU-8聚合物材料制作的絕緣微柱介電電泳芯片(圖7)，用于分離和富集直徑為16 m的乳膠粒子。受到電場強(qiáng)度較大區(qū)域(微圓柱周圍)吸引的粒子將在圓柱周圍產(chǎn)生集中;而沒有受到吸引的粒子會在電場強(qiáng)度較小的區(qū)域(微圓柱與微圓柱之間)成串流動，從而達(dá)到微粒分離的目的。

圖7 直流式-絕緣微柱電極［58］Fig.7 Direct current-insulated micro-column electrodes.

采用絕緣微柱構(gòu)建的介電電泳芯片，由于直流電壓同時(shí)作為待分析樣品的驅(qū)動電壓和富集分離電壓，必然導(dǎo)致樣品緩沖液中電流值的增加，從而對生物樣品的活性造成破壞，如細(xì)胞膜被擊穿等。然而，在實(shí)際的科研中，使用直流介電電泳的機(jī)會較少，使用交流信號介電電泳則比較普遍，這是因?yàn)楸M管介電電泳理論上并沒有限制直流電的使用，然而高頻交流電的使用可以更有效地消除直流電所引起的電解、電熱等問題，因此目前絕大部分實(shí)驗(yàn)中都使用高頻交流電產(chǎn)生所需的電場，以避免在電極附近區(qū)域過熱或發(fā)生電解。

3.3.2 交流式-介電電泳芯片(AC-DEP Chip) 在直流介電電泳中，電場會以焦耳熱的形式產(chǎn)生功率損耗，相應(yīng)的溫度變化可能會對細(xì)胞生理狀態(tài)產(chǎn)生負(fù)面影響。目前己知較高的溫度(高于細(xì)胞生理溫度4℃以上)將導(dǎo)致細(xì)胞迅速死亡。而在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞動力學(xué)過程和溫度呈指數(shù)關(guān)系，所以很小的溫度漂移也可能對細(xì)胞生理狀態(tài)造成影響。目前關(guān)于誘導(dǎo)細(xì)胞響應(yīng)所需要的最小的溫度漂移還不清楚。所以實(shí)驗(yàn)中必須盡力減小化溫度漂移。通常認(rèn)為保持溫度變化＜1℃是可以接受的，這個(gè)溫度變化和體內(nèi)溫度變化相近，不會對細(xì)胞有明顯影響。而交流電在降低功率損耗方面具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢，這就使得交流式－介電電泳在分離研究中較直流式-介電電泳具有更廣闊的應(yīng)用。

(1)信號頻率恒定的介電電泳芯片 信號頻率恒定的介電電泳是最簡單、最基本、最早研究的介電電泳形式。其特點(diǎn)是使用兩相相位相反的交流信號，形成非均勻電場，使細(xì)胞在非均勻電場中產(chǎn)生感應(yīng)偶極矩，從而受到介電電泳力的作用。根據(jù)細(xì)胞和懸浮液介電性質(zhì)的差異，細(xì)胞將向電場中電場最強(qiáng)(pDEP)或者最弱的地方運(yùn)動(nDEP)。利用微加工技術(shù)，現(xiàn)已設(shè)計(jì)制作出多種具有確定電場分布的信號頻率恒定的介電電泳芯片，電極的形狀主要有多項(xiàng)式函數(shù)形、正弦函數(shù)形、城堡形以及可單獨(dú)尋址的圓形電極陣列等。

2005年，韓國的Doh等［59］報(bào)道了一種可連續(xù)分離細(xì)胞的微流控芯片(圖8)，在該芯片流路的底部或者通道側(cè)壁配置電極，施加恰當(dāng)?shù)慕涣餍盘枺?dāng)混合樣品流過分離通道的時(shí)候，一種細(xì)胞受正向介電電泳作用從而產(chǎn)生一個(gè)與流路垂直的遠(yuǎn)離原混合流體中心位置的橫向偏移量，隨著流動的持續(xù)，這種橫向偏移量會越來越大，細(xì)胞將從出口1流出;而另一種細(xì)胞受負(fù)向介電電泳作用，則仍按原軌跡運(yùn)動，從出口2流出。Doh等［59］使用該方法進(jìn)行了活、死酵母細(xì)胞的分離，由于缺乏對流體力與介電電泳力共同作用于樣品體系時(shí)受力情況的深入討論，采用該介電電泳芯片在出口處收集的酵母菌純度低于80%。

圖8 信號頻率恒定的介電電泳芯片［59］Fig.8 Dielectrophoretic chip with constant frequency signal［59］

信號頻率恒定的介電電泳芯片是使用非常廣泛的一種微流控芯片，該芯片對信號要求較低，只需選擇使兩種細(xì)胞分別處于正、負(fù)介電電泳的頻率即可完成分離，如果需要高精度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需考慮流場的影響。在條件不足的情況下，使用尋常的信號發(fā)生器也可以勉強(qiáng)用于實(shí)驗(yàn)，對信號源的依賴性較小，但是為了獲得更好的分離效果，信號源的帶負(fù)載能力是不能忽視的指標(biāo)。

(2)行波介電電泳芯片(Traveling wave dielectrophoresis，twDEP) 與信號頻率恒定的介電電泳不同，行波介電電泳一般采用四相交流信號，相鄰電極之間施加的信號相位差為90°。該方法一般通過在一系列線性排列的電極上施加上述交流信號，構(gòu)建一個(gè)空間行波電場，其相位沿著電極排列的方向變化。當(dāng)細(xì)胞處于這樣的電場中時(shí)不僅會受到由于電場強(qiáng)度分布不均勻產(chǎn)生的介電電泳力，即常規(guī)介電電泳力;同時(shí)也會受到由于電場相位分布不均勻而產(chǎn)生的介電電泳力，稱為行波介電電泳力［60］。細(xì)胞在行波介電電泳力作用下的運(yùn)動稱為行波介電電泳。此處需注意的是，使用公式(1)計(jì)算行波介電電泳力并不合適，因?yàn)槌Ｒ?guī)的介電電泳所用交變電場的頻率和相位是固定值，然而行波介電電泳的相位不固定，需使用更為復(fù)雜的計(jì)算方法。

最早開展這方面研究的是Masuda研究小組，他們于1980年代后期報(bào)道了在同步移動電場的作用下可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與電場一起運(yùn)動［61］。Fuhr及其合作者發(fā)展了他們的工作，研究了twDEP與電旋轉(zhuǎn)原理上的相似性，并提出了“異步”行波介電電泳的概念和具體實(shí)施方案［62］。目前，已有多種電極形狀和尺寸不同的行波介電電泳芯片被設(shè)計(jì)出來［63，64］。如圖9所示，圖中電極寬度與間距均為20 μm，電極與流動方向平行，在不同電極上施加不同相位(相位相差90°)的信號產(chǎn)生twDEP力，不同細(xì)胞或顆粒在twDEP作用下的側(cè)向運(yùn)動速度存在差別，最終，在twDEP作用下使顆粒產(chǎn)生垂直于流動方向的運(yùn)動，達(dá)到很好的空間效果［33］。行波介電電泳芯片對于信號要求較高，且電極分布需合理，理論較常規(guī)介電電泳較為復(fù)雜，但對于多種(大于兩種)細(xì)胞或者微粒的具有較為明顯的優(yōu)勢，分離精度較高。

在分離操作中，外加電場信號是介電電泳分離活動的核心因素，是分離活動成功與否的關(guān)鍵，因此，針對不同的芯片結(jié)構(gòu)，不同的分離目標(biāo)以及對分離速度要求等因素的考慮，選擇合適的電場信號，能夠有效地提高分離效率。此外，除了外加信號的不同以外，流體的流動作用不可忽視，流體流動除了能推動細(xì)胞向分離區(qū)域流動外，還可改變細(xì)胞與電極之間的相對位置，對分離過程影響很大。單純依靠電場DEP作用只能在小范圍內(nèi)對細(xì)胞進(jìn)行操縱，想要分離過程滿足高通量和高效率，引入其它物理場是常采用的技術(shù)手段。現(xiàn)階段大多數(shù)研究人員認(rèn)為多物理場之間是互不影響的，但事實(shí)卻并非如此。

圖9 行波介電電泳分離細(xì)胞微流控芯片［33］Fig.9 Traveling wave dielectrophoresis(TWDEP)microfluidic chip［33］

4 結(jié)論和展望

自從1991年英國學(xué)者Pethig利用交流電場將細(xì)胞從液體中成功分離以來，使用介電電泳分離細(xì)胞已經(jīng)開展了20余年的研究［8］。隨著微加工技術(shù)的發(fā)展，介電電泳和微流控芯片攜手，使細(xì)胞分離進(jìn)入了微觀時(shí)代。在這期間，介電電泳理論得到長足的發(fā)展，新的細(xì)胞分離模型不斷出現(xiàn)，各種結(jié)構(gòu)的微流控細(xì)胞分離芯片被報(bào)道出來，從最開始的單一非均勻電場到后來的多物理場相結(jié)合，每一次創(chuàng)新都是對該領(lǐng)域的重大貢獻(xiàn)。

基于介電電泳的細(xì)胞分離微流控芯片在未來的發(fā)展將著重于以下五方面:(1)在理論和仿真研究中，各種模型的建立還有待進(jìn)一步完善。此處的模型不僅是指細(xì)胞模型，而且還有多物理場耦合時(shí)互相影響的模型。(2)分離過程的高精度和高效率。更多不同結(jié)構(gòu)和不同分離方法的微流控芯片是有效的手段。(3)拓展介電電泳分離的應(yīng)用范圍?？梢詫ζ渌男┝Ｗ舆M(jìn)行分離，如礦物質(zhì)粒子、膠體粒子等，而且對于粒子的形態(tài)也可以廣泛化，除了固態(tài)粒子，液態(tài)粒子也可以考慮作為分離對象之一;此外，分離尺寸從微米粒子到納米粒子都可以作為適用范圍。(4)芯片上多功能集成。實(shí)驗(yàn)時(shí)需要在芯片上集成多種檢測分析方法，實(shí)時(shí)準(zhǔn)確地觀察和分析細(xì)胞分離的進(jìn)程;為了排除細(xì)胞懸液中其它物質(zhì)的影響或者實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的富集，需要集成樣品前處理模塊;為了實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分析和再利用，需要集成細(xì)胞分離后的培養(yǎng)等模塊。(5)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的小型化、自動化?，F(xiàn)階段實(shí)驗(yàn)經(jīng)常使用高倍數(shù)顯微鏡配置成像系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察，新的顯微成像方法如無鏡頭陰影成像技術(shù)［65］等可以用于實(shí)驗(yàn)，體積和造價(jià)均遠(yuǎn)低于前者;分離之后統(tǒng)計(jì)的方法也有待進(jìn)一步完善，現(xiàn)在的方法比較原始，采取顯微鏡視野下的人工計(jì)數(shù)得到結(jié)果，在今后的實(shí)驗(yàn)中可以考慮引入圖像處理的方法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，效率更高，自動化程度更高。此外，在有些方面還需要進(jìn)行改進(jìn)，如分離后細(xì)胞的存活率分析［66］等。

基于介電電泳的細(xì)胞分離微流控芯片的發(fā)展與數(shù)學(xué)、物理、生物、分析化學(xué)、微加工技術(shù)的研究緊密相關(guān)。一方面，細(xì)胞分離微流控芯片的設(shè)計(jì)和制作，以微加工技術(shù)，數(shù)值模擬技術(shù)，生物標(biāo)志和化學(xué)分析為基礎(chǔ);另一方面，對基于介電電泳的細(xì)胞分離微流控芯片的研究，進(jìn)一步推動微加工技術(shù)的發(fā)展，特別是芯片上細(xì)胞的操縱技術(shù)的發(fā)展，將對生物、分析化學(xué)技術(shù)的長足發(fā)展貢獻(xiàn)一份力量。隨著微流控技術(shù)的快速發(fā)展，相信在不遠(yuǎn)的將來，高精度、高通量、高效率、多功能、便攜式、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的細(xì)胞分離微流控芯片將在生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

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