張亞妮等

摘要：從武漢地區(qū)土壤中分離得到一株真菌菌株SF-21483，其發(fā)酵液具有較強的抑制真菌的作用。本研究以真菌SF-21483發(fā)酵提取物中的活性代謝產(chǎn)物為研究對象，應(yīng)用高效制備液相色譜經(jīng)過2次分離純化，得到了5個化合物。根據(jù)紫外吸收光譜、分子離子峰、物理性狀及活性情況等確定組分4、5、7、9、10與冬青生菌素（Ilicicolin）F、E、D、C、H較為相似，對植物病原菌生物活性測試表明，該類組分具有較強的抗菌作用。

關(guān)鍵詞：真菌菌株SF-21483；農(nóng)藥活性物質(zhì)；分離；純化；冬青生菌素（Ilicicolin）

中圖分類號：S482.2 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）17-4188-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.17.020

從微生物中篩選天然物質(zhì)始于1929年青霉素的發(fā)現(xiàn)，自20世紀(jì)40年代，至今已發(fā)現(xiàn)一萬余種抗菌素[1]。微生物在其生長過程中會產(chǎn)生一些初生及次生代謝產(chǎn)物。農(nóng)用抗生素是微生物產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，可用于防治農(nóng)業(yè)有害生物，是一類用途很廣泛、 產(chǎn)業(yè)化程度很高的生物農(nóng)藥[2]。本研究在武漢某地土樣中分離得到一株真菌菌株（編號為SF-21483），對SF-21483的發(fā)酵提取物進行化學(xué)成分的分析，從中分離到5個化合物，研究包括真菌SF-21483的發(fā)酵、提取、分離純化，初步確定其結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：麥芽糖6.25 g，麥芽提取物6.25 g，酵母提取物1.00 g，磷酸二氫鉀1.25 g，硫酸鎂 0.625 g，蛋白胨 0.625 g，瓊脂粉15.00 g，去離子水1 000 mL。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 72.00 g，蛋白胨8.00 g，酵母提取物4.00 g，磷酸二氫鉀2.00 g，硫酸鎂1.00 g，鹽酸硫胺0.10 g，pH 6.0，去離子水1 000 mL。

1.1.2 主要儀器 Water 2695高效液相色譜儀（Waters 996二級管陣列檢測器，色譜工作站MasslynxV4.0），高效制備液相色譜儀（Waters2525泵，帶2767自動收集系統(tǒng)，2996二級管陣列檢測器，色譜工作站MasslynxV4.0）；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：Waters 2695高效液相色譜系統(tǒng)，美國Micromass Quattro micro？誖質(zhì)譜儀（電噴霧離子源（ESI）），Masslynx V4.1液質(zhì)聯(lián)用分析軟件。

1.1.3 主要試劑 甲醇（色譜純，德國CNW），乙腈（色譜純，德國CNW），去離子水（Millipore）。液質(zhì)聯(lián)用分析所用的高純氮氣購自武漢和遠(yuǎn)漢盛氣體有限公司，純度為99.999%。

1.1.4 菌株來源 真菌菌種SF-21483由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物農(nóng)藥工程研究中心分離、保存。黃色鐮刀菌（Fusarium culmorum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、葡萄灰霉（Botrytis cinema）、小麥穎枯病菌（Septoria nodorum）、番茄早疫菌（Alternaria solani），由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物農(nóng)藥工程研究中心提供。

1.2 色譜條件

1.2.1 分析條件 色譜柱：美國Sunfire？誖 C18 柱，150 mm×2.1 mm（i.d），粒徑3.5 μm。柱溫40 ℃。流動相：A.去離子水；B.乙腈（梯度洗脫）。進樣量3 μL。流速0.3 mL/min。檢測條件：PDA全波長掃描。

1.2.2 制備條件 色譜柱：美國Sunfire？誖 OBD C18 Prep柱，250 mm×19 mm（i.d），粒徑10 μm。柱溫室溫。流動相：A.去離子水；B.乙腈（梯度洗脫）。進樣量3 000 μL。流速27 mL/min。檢測條件：PDA全波長掃描。

1.2.3 質(zhì)譜檢測條件 MS條件：電噴霧電離（ESI），毛細(xì)管電壓為3.5 kV，錐孔電壓為45 V，離子源溫度為100 ℃，脫溶劑溫度為300 ℃，脫溶劑氣體流速500 L/h，錐孔氣體流速為50 L/h。

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng) 用無菌接種環(huán)從斜面中取少量孢子或菌絲轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基中，在旋轉(zhuǎn)式搖床上28 ℃、130～140 r/min培養(yǎng)96 h。每次每菌株準(zhǔn)備10瓶。移種前，對每瓶種子進行取樣鏡檢，以排除有污染的搖瓶。

1.3.2 搖瓶發(fā)酵 待種子培養(yǎng)好時，轉(zhuǎn)入500 mL錐形瓶中裝樣100 mL，接種后的錐形瓶置于旋轉(zhuǎn)式搖床上28 ℃、130～140 r/min培養(yǎng)7 d。

1.3.3 活性物質(zhì)的提取 將真菌SF-21483發(fā)酵液離心，分別將菌絲體和上清用乙酸乙酯進行提取2次，合并提取液，真空減壓濃縮至干，加入適量甲醇，離心，備用。

1.3.4 活性成分分布 取少量備用液進行半制備，所用色譜柱為美國Sunfire？誖C18反相柱（10 μm，250 mm×10 mm）， 進樣體積800 μL，柱溫為室溫，流速為7.5 mL/min，流動相為乙腈和去離子水，采用梯度洗脫，乙腈的濃度在25 min內(nèi)由5%變至100%。每分鐘收集一個組分，用干凈空氣吹干后進行生物活性測定，確定活性成分分布位置。

1.3.5 純品的制備 根據(jù)1.3.4活性分布結(jié)果，確定活性部位的保留時間。先采用分析液相摸索出適合活性化合物分離的流動相梯度。然后將此梯度直接放大到制備液相中，分離純化出活性物質(zhì)單組分，制備時所用色譜柱為美國Sunfire？誖prep-C18反相柱（5 μm，19 mm×250 mm）， 進樣體積2 000 μL，柱溫為室溫，流速為27 mL/min。

1.3.6 組分純度及分子量的測定 將1.3.5分離純化的單組分化合物干燥，溶于色譜級甲醇中，取1 mL于LC-MS檢測，確定化合物的純度及分子離子峰，根據(jù)紫外吸收光譜、分子離子峰及碎片離子判斷化合物的歸屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌SF-21483發(fā)酵提取物中活性組分的測定

半制備活性跟蹤試驗顯示，主要活性組分出現(xiàn)在20～26 min內(nèi)。結(jié)果表明，此段組分具有較強的抗真菌活性，其余保留時間均無活性（圖1）。通過圖1可知，20～26 min的組分主要有peak19.90、peak23.42、peak24.77和peak25.82。

2.2 真菌SF-21483活性化合物的分離純化

根據(jù)2.1活性分布結(jié)果，明確活性部位的保留時間分布在20～26 min。由此，先采用分析液相考察在1.2.1色譜條件梯度下保留此時間段的分離度。檢測結(jié)果表明，20～26 min時段內(nèi)組分較為集中，分離度較小。雖然半制備結(jié)果表明主要含有5個活性組分，但是LC-MS檢測結(jié)果表明20～26 min時段內(nèi)含有較多的化合物（圖2），這可能和分析柱的柱效較高有關(guān)。本試驗半制備的色譜柱粒徑10 μm，而分析液相色譜柱的粒徑為3.5 μm，柱效（理論塔板數(shù)）遠(yuǎn)高于半制備色譜柱[3]。因而在分析條件下，更能清晰的檢測出相同時間段所有組分。這些化合物的紫外最大吸收值較為接近，均在230、290、345 nm左右，由此判斷，可能是同系物或者類似物。因為這些化合物均集中在20～26 min時段內(nèi)，此段化合物屬于中等偏弱極性化合物。對此較為集中且組分較多的樣品分離純化，先采用梯度1條件，每個峰均收集。然后根據(jù)梯度1的保留時間段流動相配比，設(shè)計出梯度2[4]，將這些收集到的組分再進一步分離純化，得到了5個純度較高的化合物，這些化合物的理化性質(zhì)見表2。

2.3 真菌SF-21483發(fā)酵提取物中的各活性組分LC-MS歸屬

將得到的5個化合物分別稱量1 mg溶于1 mL甲醇中，于LC-MS上進樣5 μL，測定各個組分的分子離子峰（表3）。由表3可知，這5個活性組分的分子離子峰分別為4（462.2）、5（402.2）、7（404.2）、9（406.2）、10（433.3）。紫外吸收光譜也較為接近，最大吸收值分別在230、290、345左右。對比這些化合物紫外吸收光譜、相對分子質(zhì)量、物理性狀、來源及生物活性，經(jīng)過查詢天然產(chǎn)物化合物詞典（DNP）和文獻，初步推斷4、5、7、9、10這5個組分與冬青生菌素較為接近[5-7]。冬青生菌素是由真菌Cylinddrocladium ilicicola MFC-870產(chǎn)生的抗生素[8，9]，含有A、B、C、D、E、F、G和H等8個組分。相對分子質(zhì)量分別為A 390、B 356、C 406、 D 404、E 402、F 462、G 404、H 433，最大紫外吸收值分別為A ：230、296、344，B： 233、 296、 340，C： 230、295、347， D： 240、250、292、346，E： 240、 290、346，F(xiàn)： 240、294、348，G：230、295、349， H： 248、349。而4、5、7、9、10這5個活性組分是由真菌菌株SF-21483產(chǎn)生，分子離子峰分別為4（462.2）、5（402.2）、7（404.2）、9（406.2）、10（433.3）。紫外吸收值也較為接近：4（242、292、337）、5（236、291、337）、7（237、298、338）、9（230、292、348）、10（245、347）。物理性狀分別為4（淡黃色結(jié)晶）、5（淡黃色結(jié)晶）、7（淡黃色結(jié)晶）、9（黃色針狀結(jié)晶）、10（黃色針狀結(jié)晶）。結(jié)果表明，5個組分均具有一定的抗真菌活性。由此判斷，活性組分4為冬青生菌素F（Ilicicolin F）、活性組分5為冬青生菌素E（Ilicicolin E）、活性組分7為冬青生菌素D（Ilicicolin D）、活性組分9為冬青生菌素C（Ilicicolin C）、活性組分10為冬青生菌素H（Ilicicolin H）。

2.4 SF-21483發(fā)酵提取物中各活性組分的抑菌活性

將SF-21483發(fā)酵提取物分離純化得到的這5個活性組分分別在5個真菌病原菌靶標(biāo)下的1.0、0.3、0.1 mg/mL濃度下進行生物活性測試，結(jié)果表明，這些活性組分均具有一定的抑制植物病原真菌的作用（表4）。由表4可知，活性組分4僅在1.0 mg/mL濃度下有活性；活性組分4在3個濃度下均對小麥穎枯、立枯絲核菌均有較強的抑制作用；活性組分5的活性最強，在3個濃度下對其中的3個靶標(biāo)均具有較強的活性；活性組分9對小麥穎枯、番茄早疫在3個濃度下有較強的活性；活性組分10對葡萄灰霉、番茄早疫、立枯絲核具有一定的抑制作用。

3 小結(jié)與討論

本試驗從SF-21483的發(fā)酵提取物中分離得到的組分4、5、7、9、10與化合物冬青生菌素（Ilicicolins）相似，具有較強抗真菌作用。文獻研究多集中在Ilicicolin H，它是2-吡啶酮類化合物。體外抗菌活性研究表明，該化合物抑制炭疽桿菌（Bacillus anthracis）的劑量為6 mg/mL[8]。其作用機制在最近才被闡明，在酵母中作用于線粒體， 抑制呼吸鏈中泛醌位點[10]。目前該類化合物的研究主要集中在抗菌機理上，在農(nóng)藥應(yīng)用方面的研究很少報道。本試驗主要是從真菌SF-21483的次生代謝產(chǎn)物應(yīng)用于植物病原菌的防治上進行了研究，為真菌SF-21483在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用做了初步的探討。

參考文獻：

[1] B？魪RDY J. Bioactive microbial metabolites[J]. J Antibiot，2005， 58（1）：1-26.

[2] 朱昌雄，蔣細(xì)良，姬軍紅，等.我國生物農(nóng)藥的研究進展及對未來發(fā)展建議[J].現(xiàn)代化工，2003，23（7）：1-4.

[3] 劉國詮，于兆樓.色譜柱技術(shù)[M].第二版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[4] 張亞妮，王開梅，張志剛，等.放線菌菌株WS-13182產(chǎn)生的活性物質(zhì)的分離純化[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（11）：33-36.

[5] GUTI？魪RREZ M，THEODULOZ C，RODR？魱QUEZ J，et al. Bioactive metabolites from the fungus Nectria galligena， the main apple canker agent in Chile[J]. J Agric Food Chem，2005，53（20）：7701-7708.

[6] SINGH S B， LIU W G， LI X H， et al. Antifungal spectrum， in vivo efficacy， and structure-activity relationship of ilicicolin h[J].ACS medicinal chemistry letters，2012，3（10）：814-817.

[7] 邵志宇，馮永紅，鄧云霞，等.互花米草內(nèi)生真菌Fusarium sp.F4中的活性代謝物[J].中國天然藥物，2007，5（2）：108-111.

[8] HAYAKAWA S，MINATO H，KATAGIRI K. The ilicicolins， antibiotics from Cylindrocladium ilicicola[J]. J Antibiot，1971，24（9）：653-654.

[9] MINATO H，KATAYAMA T，HAYAKAWA S. Identification of ilicicolins with ascochlorin and LL-Z1272[J]. J Antibiot，1972， 25（5）：315-316.

[10] GUTIERREZ-CIRLOS E B，MERBITZ-ZAHRADNIK T，TRUMPOWER B L. Inhibition of the yeast cytochrome bc1 complex by ilicicolin H， a novel inhibi tor that acts at the qn sit e of the bc1 complex[J]. J Biol Chem，2004，279（10）：8708-8714.