高英

（遼寧省北鎮(zhèn)市動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 北鎮(zhèn) 121300）

豬偽狂犬病病毒在不同細(xì)胞中增殖情況的比較

高英

（遼寧省北鎮(zhèn)市動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 北鎮(zhèn) 121300）

豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病毒（PRV）引起的以發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎為主要特征的急性傳染病。隨著中國規(guī)?；图s化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，從國外引進(jìn)的種豬相應(yīng)增多，偽狂犬病隨之傳入并不斷蔓延擴(kuò)大，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，中國將其列為二類傳染病。由于PRV目前尚無有效的藥物治療方法，因此，該病的預(yù)防免疫就顯得更為重要。PRV在細(xì)胞上繁殖的效率影響著疫苗的免疫質(zhì)量，因此本實(shí)驗將PRV在ST、BHK-21、PK-15、Vero上的增殖情況進(jìn)行比較，篩選出適合PRV增殖的細(xì)胞，為豬偽狂犬病疫苗的生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)抗原。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞及病毒

豬睪丸傳代細(xì)胞（ST）、BHK-21細(xì)胞、豬腎傳代細(xì)胞（PK-15）、非洲綠猴腎傳代細(xì)胞（Vero）均由本實(shí)驗室保存。

豬偽狂犬病病毒PRV由本實(shí)驗室分離鑒定并保存。

1.2試劑

DMEM、新生犢牛血清均購自GIBCO公司。

1.3方法

1.3.1病毒增殖將培養(yǎng)的ST、BHK-21、PK-15、MVero等細(xì)胞置于顯微鏡下觀察，待細(xì)胞長成致密單層后即可用于病毒繁殖。每種細(xì)胞取三瓶，棄去生長液，兩瓶用于病毒增殖，一瓶作為對照。每個細(xì)胞瓶中按維持液的1%接種PRV病毒，置于37℃孵育1h，棄去病毒液，每瓶加入10mL含2%新生犢牛血清的維持液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞病變情況，當(dāng)80%細(xì)胞發(fā)生病變時收毒，將細(xì)胞瓶置于-20℃冰箱中反復(fù)凍融3次，保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2病毒含量測定用DMEM培養(yǎng)液將病毒液作10倍系列稀釋，即10-1、10-2……10-8，分別取100μL加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個稀釋度作6個重復(fù)，然后，每孔加入100μL經(jīng)胰蛋白酶-EDTA消化分散的BHK21細(xì)胞懸液，并設(shè)正常細(xì)胞對照，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變和細(xì)胞對照，觀察2～4d，記錄細(xì)胞病變的孔數(shù)，并按照Reed-Muench法計算病毒液的TCID50。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞病變情況

表1　各種細(xì)胞病變情況

2.2病毒含量（TCID50）測定結(jié)果

由表2可以看出PRV在BHK-21細(xì)胞上增殖的病毒含量較高，達(dá)到108.6 TCID50/mL，在PK-15細(xì)胞上增殖較慢，僅為107.2 TCID50/mL。

表2　PRV在不同細(xì)胞中的TCID50

3　討論

PRV能在多種細(xì)胞中增殖，但是在不同細(xì)胞上增殖的病變和病毒含量具有較大差異，選擇一種最合適的細(xì)胞進(jìn)行增殖不僅省時、省力，而且能得到較高純度的抗原，為疫苗的生產(chǎn)提高了工作效率。本實(shí)驗探索PRV在ST、BHK-21、PK-15 和Vero四種細(xì)胞上增殖的情況，篩選出一種較適合PRV增殖的細(xì)胞。PRV在BHK-21細(xì)胞上出現(xiàn)病變的時間較早，并且病變細(xì)胞圓縮，聚集，呈拉網(wǎng)狀，易于判斷，病毒含量也較高，能夠達(dá)到108.6 TCID50/mL，在生產(chǎn)上即省時，又能獲得較高的抗原濃度；所以在實(shí)際的生產(chǎn)實(shí)踐中，BHK-21細(xì)胞可以作為PRV增殖的理想細(xì)胞。

10.3969/J.ISSN.1671-6027.2015.07.077