包廣潔 孔楠楠 郭曼麗 蘇雪蓮 康宏

1.西北民族大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)國家民族事務(wù)委員會重點實驗室，蘭州 730030；2.蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究所，蘭州 730000

顳下頜關(guān)節(jié)盤是位于顳骨關(guān)節(jié)窩和下頜骨髁突之間的纖維軟骨樣組織，在顳下頜關(guān)節(jié)行使功能過程中起到緩沖應(yīng)力的作用[1]。隨著年齡和顳下頜關(guān)節(jié)功能位置、負荷大小的改變，顳下頜關(guān)節(jié)盤也會發(fā)生相應(yīng)的組織改建[2]。據(jù)報道[3]，有20%～50%的人由于關(guān)節(jié)盤變性、變薄、穿孔等原因罹患關(guān)節(jié)盤功能障礙性疾?。欢壳暗闹委煼椒ǔ耸中g(shù)摘除之外，仍缺乏其他有效的措施。

細胞替代療法是迄今最有前景的治療關(guān)節(jié)軟骨缺損的方法[4]，該方法中種子細胞的選擇非常關(guān)鍵。自體或異體的顳下頜關(guān)節(jié)盤細胞是重要的種子細胞來源，目前對其分類和分型已取得了初步進展，從組織學(xué)上可分為軟骨細胞樣細胞和成纖維細胞樣細胞[5-7]，但兩種類型的細胞在生物力學(xué)方面的反應(yīng)特性尚不清楚。

生物原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）[8]具有納米級分辨率，且易于操作，便于定量測定生物樣本的結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能，因而廣泛用于細胞形態(tài)和生物力學(xué)研究中[9]。AFM通過高度靈敏的懸臂獲取細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、剛度和黏附力[10]，這些特征可以揭示細胞的表面結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能以及與細胞功能之間的關(guān)系。本研究通過AFM接觸模式獲取顳下頜關(guān)節(jié)盤軟骨細胞樣細胞和成纖維細胞樣細胞的超微形貌特征，通過AFM力學(xué)模式獲取相關(guān)數(shù)據(jù)，對比細胞彈性和黏附力，探索顳下頜關(guān)節(jié)盤細胞的生物力學(xué)特性，為工程化顳下頜關(guān)節(jié)盤組織的后續(xù)研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 關(guān)節(jié)盤細胞的分離與培養(yǎng)

分批購置新鮮屠宰的1月齡山羊頭，充分清潔，75%乙醇中浸泡30 min。在無菌條件下取出雙側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)盤，修剪周圍組織，用含100 U·mL-1青霉素和0.1 g·L-1鏈霉素雙抗的PBS充分沖洗3次，移入50 mL小燒杯中，將其剪碎至約1 mm3大小；加10 mL 0.2%Ⅰ型膠原酶（Sigma公司，美國），于37 ℃、86 r·min-1搖床上消化15 h。H-DMEM培養(yǎng)液（Hyclone公司，美國）重懸離心，收集細胞。一部分細胞以每毫升1×105個的密度接種于培養(yǎng)皿（無錫耐思生物科技有限公司）中，另一部分按每毫升2×105個的密度接種于50 mL培養(yǎng)瓶；加5 mL完全培養(yǎng)液，其中含有15%胎牛血清（杭州四季青生物科技有限公司）、1%維生素C（Sigma公司，美國）、2 mmoL·L-1谷氨酰胺（Sigma公司，美國）和1%青霉素-鏈霉素（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），于37 ℃、5%CO2及飽和濕度恒溫箱（HF90 Heal Force型二氧化碳培養(yǎng)箱，上海力申科學(xué)儀器有限公司）內(nèi)培養(yǎng)，待細胞融合至85%～90%后以胰酶（Sigma公司，美國）消化，然后傳代。

1.2 關(guān)節(jié)盤細胞的鑒定

收集第1代關(guān)節(jié)盤細胞，制作細胞爬片，培養(yǎng)72 h，PBS液沖洗3 次；4%多聚甲醛固定，按照免疫組織化學(xué)試劑盒（SP-9002型，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）的SP法進行Ⅰ型膠原鼠單克隆抗體（Abcam公司，英國）免疫組織化學(xué)鑒定，另外采用甲苯胺藍染色法進行酸性糖氨多糖（glycosaminoglycan，GAG）鑒定。

1.3 AFM形貌測定

1.3.1 關(guān)節(jié)盤細胞表面形貌成像 接種到培養(yǎng)皿中的原代細胞培養(yǎng)2 d，待細胞充分伸展，更換不含胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，然后進行Bio-AFM成像。使用安裝在Axiovert200 型倒置顯微鏡（卡爾蔡司公司，德國）上的JPK Nano Wizard 3型AFM（JPK公司，德國）進行關(guān)節(jié)盤細胞成像。光鏡下分別挑選三角形的軟骨細胞樣細胞和長梭形的成纖維細胞樣細胞，使用80 μm×80 μm大范圍掃描器和PNP-TR三角形懸臂硅探針（Nanoworld公司，美國）探頭進行接觸模式掃描，掃描速度為0.1～0.25 Hz·s-1，接觸模式下采用的恒定的經(jīng)驗側(cè)向力值（Setpoint）為0.533 nN，單次掃描持續(xù)和形貌復(fù)原時間為15 min。將掃描獲得的細胞表面形貌圖像用AFM系統(tǒng)的JPK Data Processing軟件進行分析，從細胞納米分辨率水平上比較兩種類型的關(guān)節(jié)盤細胞在生物力學(xué)特性上的差異。

1.3.2 細胞膜表面粗糙度分析 平均表面粗糙度Ra是細胞表面高度平均值的算術(shù)平均偏差，Rq為其均方根。在AFM細胞形貌圖上隨機選擇20個2 μm×2 μm的區(qū)域，通過JPK Data Processing軟件獲取Ra和Rq（單位：nm）。運用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行t檢驗，檢驗水準為雙側(cè)α=0.05。

1.4 關(guān)節(jié)盤細胞生物力學(xué)特性分析

在倒置顯微鏡下分別隨機選取20個軟骨細胞樣細胞和成纖維細胞樣細胞，分別在細胞的細胞核區(qū)和細胞質(zhì)區(qū)測定細胞的生物力學(xué)特性。掃描獲得細胞的力-位移曲線，通過JPK Data Processing軟件進行數(shù)據(jù)擬合，分析兩種細胞的楊氏模量和黏附力。通過SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析和t檢驗分析，檢驗水準為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 關(guān)節(jié)盤細胞的形態(tài)學(xué)觀察

光學(xué)顯微鏡下，軟骨細胞樣細胞呈三角形，成纖維細胞樣細胞呈長梭形，二者形態(tài)完全不同。原代細胞多以長梭形的成纖維細胞樣細胞為主，部分呈圓形及多角形（軟骨細胞樣細胞），折光性強；第1代后，細胞逐漸不規(guī)則，多角形增多（圖1A）。甲苯胺藍染色細胞質(zhì)呈紫藍色（圖1B），說明關(guān)節(jié)盤細胞具有成軟骨的特性。Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色可見細胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色的陽性染色顆粒（圖1C），說明關(guān)節(jié)盤細胞有成纖維特性。

圖1 顳下頜關(guān)節(jié)盤細胞的形態(tài)學(xué)觀察 光學(xué)顯微鏡 × 100Fig 1 Morphological observation of temporomandibular joint disc cells optical microscope × 100

2.2 兩種類型關(guān)節(jié)盤細胞AFM形貌觀察

單細胞的AFM圖像能夠顯示出細胞表面的超微結(jié)構(gòu)，軟骨細胞樣細胞和成纖維細胞樣細胞的形貌特征見圖2。觀察AFM高度圖可見，軟骨細胞樣細胞的細胞體高亮，邊緣部分略暗，比較圖中黑色橫截線所對應(yīng)的曲線圖發(fā)現(xiàn)，細胞質(zhì)和細胞核過渡不明顯（圖2E）。成纖維細胞樣細胞的細胞核部分高亮，呈橢圓形，向細胞質(zhì)部分逐漸變暗，相應(yīng)的曲線剖面圖顯示，從細胞核到細胞質(zhì)區(qū)呈一個平緩的斜坡狀過渡（圖2G）。二者的三維重建圖（圖2B、D）同樣可以看出這種趨勢。AFM偏轉(zhuǎn)圖能夠觀察到軟骨細胞樣細胞邊緣伸出許多偽足，緊密貼合于培養(yǎng)皿基底，細胞連結(jié)部分的偽足相互交錯，結(jié)合緊密，細胞體可見縱橫交錯呈樹枝狀的骨架結(jié)構(gòu)，黑色橫截線所對應(yīng)的曲線圖發(fā)現(xiàn)細胞表面輪廓凹凸不平，骨架結(jié)構(gòu)明顯凸起，支撐細胞的整體形態(tài)（圖2F）。成纖維細胞樣細胞邊緣光滑，極少有偽足伸出，骨架結(jié)構(gòu)在細胞質(zhì)區(qū)規(guī)則排列（圖2H）。

2.3 表面粗糙度分析

軟骨細胞樣細胞表面的Ra和Rq分別為（55.07±24.65） nm和（63.65±33.11） nm，成纖維細胞樣細胞的Ra和Rq分別為（60.37±29.41） nm和（66.52±37.79） nm；經(jīng)t檢驗，兩種類型細胞的表面粗糙度的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（Ra：P=0.587；Rq：P=0.769），說明二者表面粗糙度接近，可能沒有區(qū)域性差異或者需要進一步加大樣本量進行分析。

2.4 兩種細胞力學(xué)特性分析

通過JPK Data Processing軟件計算得到軟骨細胞樣細胞和成纖維細胞樣細胞的細胞核區(qū)和細胞質(zhì)區(qū)的楊氏模量及黏附力見表1。經(jīng)t檢驗，兩種細胞的細胞核區(qū)楊氏模量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但是在細胞質(zhì)區(qū)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.047）；兩種細胞表面的黏附力無論是細胞核區(qū)還是細胞質(zhì)區(qū)，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 軟骨細胞樣細胞和成纖維細胞樣細胞的楊氏模量和黏附力比較Tab 1 Comparison of Young’s modulus and adhesion of chondrocyte-like cells and fi broblast-like cells

3 討論

顳下頜關(guān)節(jié)盤細胞的分型一直存在爭議，通常將兩種類型的關(guān)節(jié)盤細胞稱為軟骨細胞樣細胞和成纖維細胞樣細胞[11-12]。光鏡和電子顯微鏡觀察顯示，軟骨細胞樣細胞具有軟骨細胞典型的短小的細胞突起，具有成軟骨性；成纖維細胞樣細胞呈長梭形，是關(guān)節(jié)盤細胞的優(yōu)勢細胞[5-6,13]，但是兩種細胞的生物學(xué)功能目前尚不十分清楚。

AFM掃描的細胞表面形貌是對電鏡和熒光顯微鏡觀察的有效補充，它能夠?qū)μ幱谂囵B(yǎng)液中細胞的表面形貌及生理狀態(tài)下的力學(xué)特性作實時觀察[14]。本實驗利用AFM對兩種類型的關(guān)節(jié)盤細胞的表面超微結(jié)構(gòu)作成像對比，結(jié)果可見：軟骨細胞樣細胞較成纖維細胞樣細胞體積略小，細胞核占細胞體的大部分，細胞邊緣伸出許多偽足，骨架結(jié)構(gòu)縱橫交錯，覆蓋整個細胞體；成纖維細胞樣細胞呈長梭形，細胞核部分明顯高出細胞質(zhì)，細胞質(zhì)均勻平鋪在基底上，骨架結(jié)構(gòu)規(guī)則排列在整個細胞質(zhì)部分。細胞表面粗糙度是用來監(jiān)測細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之間的反應(yīng)并能夠反映細胞表面組成成分的一項指標[15]，本研究兩種細胞的表面粗糙度沒有明顯差異，說明兩種類型細胞的表面組成成分可能是相近的。

AFM不僅可以觀察細胞形貌[16]，也可以通過力學(xué)曲線模式測定細胞的力學(xué)性能[17]，力-位移曲線能夠反映所加載的負荷和細胞形變之間的關(guān)系，例如細胞彈性，探針與細胞表面小分子相互作用的差異等[18]。AFM是從納米微觀尺度對組織不同區(qū)域的特殊位點剛性檢測的有效方法。AFM有兩種加載模式：輕敲和接觸模式。輕敲模式采用垂直向加載，接觸模式主要為水平向加載，兩種模式都可以復(fù)原細胞形貌，本實驗采用后者。AFM在輕敲模式下的加載力為0.1～1 nN，在接觸模式下為10～40 nN，不會對細胞造成不可逆的形變，對細胞復(fù)原無影響；但是需要說明的是，多數(shù)實驗中采用的探針加載力值為經(jīng)驗值。本實驗采用恒定側(cè)向加載的方式，經(jīng)驗值（Setpoint）為0.533 nN，說明JPK Nano Wizard 3 型生物AFM用于細胞形貌觀察的力值精度較以前的AFM更為理想。有研究[19]發(fā)現(xiàn)，軟骨細胞的細胞核和細胞質(zhì)的剛性比為1.4。本研究分別測定了細胞核區(qū)和細胞質(zhì)區(qū)的剛性和黏附力，發(fā)現(xiàn)細胞核區(qū)的剛性比細胞質(zhì)區(qū)要大。成纖維細胞樣細胞骨架結(jié)構(gòu)大部分分布在細胞質(zhì)區(qū)，而軟骨細胞樣細胞骨架結(jié)構(gòu)相對集中于細胞核區(qū)，兩種細胞細胞核區(qū)的剛性相近，而細胞質(zhì)區(qū)略有差異，成纖維細胞樣細胞的剛性略大于軟骨細胞樣細胞；黏附力在兩種細胞的細胞核區(qū)和細胞質(zhì)區(qū)的差異均不明顯，說明黏附性跟細胞整體特性相關(guān)，不是由局部部位決定。

細胞力學(xué)性能對細胞與細胞之間的黏附性能（黏彈性變性）有重要的影響[20]，楊氏模量、細胞表面粗糙度和細胞黏附性之間存在正相關(guān)關(guān)系[21]，黏附事件的發(fā)生與細胞表面蛋白解聚和受體-配體、細胞骨架蛋白有關(guān)[22]。黏附性通常反映細胞表面小分子物質(zhì)的情況，單個黏附分子可以反映整體細胞的黏附特性[23]；本研究中關(guān)節(jié)盤兩種類型細胞的黏附力沒有明顯差異，表明細胞表面的小分子物質(zhì)是相近的。兩種類型的細胞雖然在形態(tài)學(xué)和分布上存在一定的差異，但是從目前的實驗結(jié)果看，關(guān)節(jié)盤細胞在生物力學(xué)特性上的差異并不明顯。這可能有兩方面的原因：一方面是兩種類型的細胞在發(fā)育和成熟階段所起的力學(xué)作用沒有差異；另一方面可能是不同細胞在特定階段的力學(xué)效應(yīng)表現(xiàn)一致，可以相互轉(zhuǎn)化。這還需要今后對細胞受力后的內(nèi)部和外部反應(yīng)進行深入研究。

本實驗利用AFM從納米尺度對軟骨細胞樣細胞和成纖維細胞樣細胞的表面結(jié)構(gòu)進行描述，并對比其生物力學(xué)特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：兩種類型的細胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的差異較大，但其生物力學(xué)特性相近。通過黏附力對比分析和黏附相關(guān)蛋白的檢測可以闡明細胞去分化的機制[24]，這為以后顳下頜關(guān)節(jié)盤組織工程研究中種子細胞的選擇提供了思路。

致謝：感謝蘭州大學(xué)土木工程與力學(xué)學(xué)院生物力學(xué)與醫(yī)學(xué)工程研究所張寶平博士在本課題AFM觀察部分給予的大力協(xié)助！

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