張海洋 施敬瑤 李長福

1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科，黑龍江哈爾濱 150040；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)一科，黑龍江哈爾濱 150040

膀胱癌手術(shù)治療后易復(fù)發(fā)， 目前的研究認(rèn)為是由于膀胱癌干細胞的存在。 腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSC） 是指存在于腫瘤組織及腫瘤細胞系中具有自我更新能力、 多向分化潛能并能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細胞的細胞群體。 腫瘤干細胞理論認(rèn)為，腫瘤干細胞表面存在能排出化療藥物的分子泵， 從而對化療藥物反應(yīng)不敏感，與腫瘤的遠處器官轉(zhuǎn)移、耐藥性的產(chǎn)生和復(fù)發(fā)均有密切關(guān)系。 只要腫瘤組織中存在少量的腫瘤干細胞，腫瘤就不可能被治愈，仍會復(fù)發(fā)。在泌尿生殖道腫瘤中， 目前僅有前列腺癌腫瘤干細胞得到成功分離和鑒定[1-2]，膀胱癌干細胞的研究也有一定的進展。

1 膀胱癌干細胞的生物學(xué)特性

1.1 膀胱癌異質(zhì)性

早在1970 年開始， 國外研究人員就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)膀胱癌腫瘤組織存在異質(zhì)性，膀胱癌腫瘤組織中存在一小部分細胞能夠在體外形成克隆，而其他絕大多數(shù)腫瘤細胞不具備這樣的特性。

1.2 極強的致瘤能力

雖然腫瘤干細胞的含量極低，但其具有極強的致瘤能力，易形成克隆或動物體內(nèi)成瘤，具有獨特的生物學(xué)特性。

1.3 自我更新并可多向分化的能力

國外學(xué)者研究將乳腺癌干細胞移植到裸鼠體內(nèi)，可以生成乳腺癌全部的腫瘤組織病理類型，這說明乳腺癌腫瘤干細胞具有自我更新與多向分化的能力[3]。Gaisa 等[4]利用雙色酶組織化學(xué)法證實尿路上皮中細胞色素氧化酶缺陷的區(qū)域存在相同的體細胞線粒體DNA 變異，表明這些區(qū)域是一個克隆單位，包含尿路上皮中所有分化階段的細胞，此項研究證實在尿路組織中存在尿路上皮干細胞。

1.4 自我保護能力

細胞周期實驗證實，腫瘤干細胞通常處于靜止?fàn)顟B(tài)，更多的腫瘤干細胞處于細胞周期的G0/G1期，而處于S 期的細胞較少，并且具有較高的DNA 修復(fù)能力，表達高水平的抗凋亡蛋白， 而且過高表達ABCG2 蛋白，其能將抗腫瘤藥物和細胞毒素泵出細胞外，從而逃避化療藥物的殺傷作用[5-6]。

2 膀胱癌干細胞的分離篩選

早在20 世紀(jì)70 年代，急性髓性白血病[7]的腫瘤干細胞是最先被發(fā)現(xiàn)及分離出來的，陸續(xù)地又有9 種人類腫瘤干細胞被成功分離鑒定，但至今仍有大部分腫瘤干細胞還未被成功分離鑒定，其中包括膀胱癌腫瘤干細胞。 國內(nèi)有學(xué)者證實了膀胱癌初始細胞EMACD44v6+細胞具有膀胱癌干細胞的特性，間接地證明存在膀胱癌干細胞，但其仍沒有成功得到分離鑒定[8]。但研究者們從未放棄對膀胱癌干細胞的分離及鑒定的探索，并已取得了一定進展。

通常分離腫瘤干細胞的方法有三種。第一種是利用干細胞表面標(biāo)志物，應(yīng)用流式細胞儀和免疫磁珠分選法進行腫瘤干細胞的篩選，這種腫瘤干細胞分離方法也是最常用的，然而膀胱尿路上皮癌沒有特定的干細胞表面標(biāo)志物[9]。Chan 等[10]利用Lineage-CD44+CK5+CK20-標(biāo)志物從原代膀胱癌細胞中成功分離出膀胱癌啟動細胞（bladder cancer-initiating cell），在小鼠體內(nèi)形成移植瘤僅需要1×102～1×103個CD44+腫瘤細胞，并且能促進膀胱癌的進展。Yang 等[8]研究利用干細胞表面標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)， 膀胱癌組織中存在的CD44v6+EMA-MUC-細胞可能是膀胱癌干細胞。Tatokoro 等[11]也通過實驗證實， 膀胱移行細胞癌5637 細胞株中的CD44+細胞亞群具有膀胱癌啟動細胞的相關(guān)特征，對化療藥物順鉑產(chǎn)生更強的耐藥抵抗力，并且表達更高的Akt 和ERK 分子致瘤性信號通路， 使用熱休克蛋白90（HSP90）信號通路抑制劑可以顯著提高膀胱癌啟動細胞對化療藥物順鉑的敏感性。 學(xué)者Su 等[12]利用乙醛脫氫酶1（ALDH-1）從膀胱移行細胞癌組織中分離膀胱癌干細胞， 發(fā)現(xiàn)ALDH-1 的表達與膀胱癌患者特異性生存率和總生存率呈負相關(guān)。 Atlasi 等[13]在2007 年首次報道了在膀胱癌細胞中存在高表達OCT-4 干細胞標(biāo)志物。 Xu 等[14]研究證實，膀胱癌組織中有少量能用全能干細胞標(biāo)志物OCT-4 成功標(biāo)記的OCT-4 陽性膀胱腫瘤細胞， 這些OCT-4 陽性腫瘤細胞被認(rèn)為可能是膀胱癌干細胞。 但是，這個全能干細胞表面標(biāo)志物OCT-4 并不是膀胱癌干細胞所特有的。所以試圖利用腫瘤干細胞表面標(biāo)志物成功分離出膀胱癌干細胞的方法需要進一步探索研究。

第二種是利用無血清培養(yǎng)基（serum-free medium，SFM）即普通干細胞的培養(yǎng)基的方法分選膀胱癌干細胞，因胎牛血清中有促進干細胞分化的營養(yǎng)成分，為了避免腫瘤干細胞分化，采用無血清培養(yǎng)基分離腫瘤干細胞。 腫瘤干細胞易呈懸浮球或微球體生長，并且可以連續(xù)傳代培養(yǎng)， 形成的腫瘤微球體與親代腫瘤球具有相同的細胞生物學(xué)特性。 有研究者發(fā)現(xiàn)，利用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤的腫瘤干細胞時，可以篩選、擴增并形成癌細胞球或微球體[15-16]，但同時這種方法會有大量的非腫瘤干細胞混入， 致使分離出的腫瘤干細胞亞群純度不高， 這也只能作為分離篩選腫瘤干細胞的輔助方法。曹正國等[17]從膀胱腫瘤組織中采用無血清懸浮培養(yǎng)法成功分離培養(yǎng)獲得膀胱癌干細胞樣細胞，其高表達PIWIL12 蛋白。 寧志豐等[18]也利用無血清懸浮培養(yǎng)從膀胱癌T24 細胞株中分離出微球體， 并驗證這些微球體有腫瘤干細胞的特點。

最后一種則是利用流式細胞儀分離側(cè)群細胞（SP）的方法。目前的研究認(rèn)為，側(cè)群細胞是具有一定干細胞特性的一類細胞亞群，能夠有效地從細胞內(nèi)泵出Hoechst 33342 染料而不被染色的一小群細胞， 普通正常細胞表面因沒有相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白而被染色，特別適用于沒有特異性干細胞表面標(biāo)志物的腫瘤干細胞篩選[19]。 Ning 等[20]在2009 年首次報道利用流式細胞術(shù)在3 種膀胱移行細胞癌細胞系EJ、UM-UC-3、T24 中篩選側(cè)群細胞，最后僅在膀胱癌細胞株T24 中發(fā)現(xiàn)了34.7%的側(cè)群細胞， 且這些篩選出的側(cè)群細胞中的絕大數(shù)處于細胞周期的G0/G1期、 具有更強的生長增殖能力和克隆形成能力，對放療及化療均不敏感。但是，腫瘤干細胞理論認(rèn)為，腫瘤干細胞在普通腫瘤細胞系中的比例小于10%，因此這種篩選側(cè)群細胞的方法仍不合適于用來分離膀胱癌干細胞，但至少，這也能說明膀胱癌T24 細胞中可能含有膀胱癌干細胞，是研究膀胱癌干細胞較好的細胞模型。

雖然，目前利用以上三種實驗方法都無法成功分離出膀胱癌干細胞。但上述研究成果為以后實驗進行人膀胱癌干細胞樣細胞的分離和鑒定提供了重要的理論基礎(chǔ)和實驗方法。 在2009 年Tan 等[21]率先利用化療藥物在小鼠荷瘤模型中分選出肝細胞癌腫瘤干細胞后，國內(nèi)有學(xué)者也開始利用化療藥物絲裂霉素C從膀胱癌移行細胞癌T24 細胞株中篩選耐藥細胞，驗證發(fā)現(xiàn)， 剩余存在7.5%的耐藥細胞可能是膀胱癌干細胞[22]。 Zhang 等[23]用高濃度化療藥物順鉑篩選出的耐藥細胞被證實是膀胱癌干細胞樣細胞。這也為進行化療藥物結(jié)合無血清培養(yǎng)基技術(shù)分選出膀胱癌干細胞樣細胞提供了實驗依據(jù)。

3 膀胱癌干細胞的治療

腫瘤干細胞理論可以解釋臨床上應(yīng)用化療藥物或和放射線治療腫瘤細胞的效果不理想的原因。普通的腫瘤細胞具有很強的增殖能力，持續(xù)地進行細胞增殖，常規(guī)的化學(xué)藥物治療或和放射治療能大量殺傷處于細胞周期增殖階段的腫瘤細胞。但腫瘤干細胞具有較強的自我更新能力，且多數(shù)腫瘤干細胞處于細胞周期的靜止期，其細胞表面具有分子泵相關(guān)蛋白，這些腫瘤干細胞表面的分子泵蛋白與正常干細胞一樣擁有排出化療藥物的功能，導(dǎo)致對化療藥物不敏感。 所以腫瘤干細胞與正常干細胞都具有抵御化療與放射治療的能力[24]。 從而使腫瘤干細胞自身逃逸了化療藥物毒性和放射線的殺傷。 雖然如此，但研究人員沒有放棄抗腫瘤干細胞藥物的研發(fā)，針對腫瘤干細胞的化療藥物已經(jīng)有了一定的發(fā)展。 Gupta 等[25]利用腫瘤干細胞成功篩選出抗乳腺癌的高效抗癌藥， 研究發(fā)現(xiàn)，某些藥物能夠有選擇性地殺傷乳腺癌干細胞，如鹽霉素藥物作用乳腺癌干細胞時，能導(dǎo)致乳腺癌干細胞某些基因表達缺失，從而起到殺傷作用。 Chan 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，免疫球蛋白樣跨膜整合素相關(guān)蛋白（IAP/CD47）幾乎在所有的膀胱癌細胞中表達，且CD47 在膀胱癌干細胞表達顯著增高。 使用單克隆抗體阻斷CD47 信號通路可以在體外誘導(dǎo)巨噬細胞對膀胱癌細胞的吞噬作用。由此，CD47 可能成為膀胱癌干細胞的一個潛在的治療靶點。目前腫瘤干細胞靶向治療的研究主要集中在表面標(biāo)志物和相關(guān)信號傳導(dǎo)途徑的小分子抑制物[26]，而靶向治療聯(lián)合傳統(tǒng)治療對腫瘤干細胞將可能會有更好的療效。

4 結(jié)語與展望

膀胱癌具有手術(shù)治療后容易復(fù)發(fā)的特點，雖然術(shù)后輔助膀胱灌注化療可以在一定程度上降低復(fù)發(fā)可能性，但臨床治療中仍有較高的復(fù)發(fā)概率。 惡性腫瘤細胞生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的特點與干細胞的基本特性十分相似。 應(yīng)尋找更有效的方法分離膀胱癌干細胞，研發(fā)抑制膀胱癌干細胞自我更新的藥物，開展針對膀胱癌干細胞的治療。 因此，尋找膀胱癌干細胞及其信號途徑中新的治療靶點將成為今后腫瘤研究的重點，更能為泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤患者帶來治療的新曙光以及為臨床腫瘤治療提供新的方向和視覺角度。

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