李明++陸曉媛

[摘要] 目的 探討胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ mRNA結(jié)合蛋白3（IMP3）的表達(dá)及微血管密度（MVD）與宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的相關(guān)性。 方法 選取2007年7月～2013年1月于連云港市婦幼保健院進(jìn)行宮頸活檢或手術(shù)切除的宮頸組織標(biāo)本存檔蠟塊100例，其中宮頸浸潤(rùn)癌50例，宮頸上皮內(nèi)瘤變35例，宮頸炎15例。采用免疫組化S-P法分別檢測(cè)IMP3與MVD在各宮頸組織中的表達(dá)。 結(jié)果 IMP3的表達(dá)及MVD在宮頸鱗癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變、正常宮頸組織中兩兩比較，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；宮頸鱗癌組織中IMP3及MVD呈高表達(dá)，并且與宮頸鱗癌臨床分期、浸潤(rùn)深度、淋巴轉(zhuǎn)移、分化程度相關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。IMP3在宮頸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率與MVD值呈正相關(guān)（r = 0.323，P < 0.05）。 結(jié)論 IMP3及MVD與宮頸癌的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，可以作為判斷宮頸上皮內(nèi)瘤變發(fā)展為浸潤(rùn)癌風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)和判斷宮頸鱗癌惡性程度和預(yù)后的良好指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 宮頸上皮內(nèi)瘤變；宮頸鱗癌；IMP3；MVD；免疫組化

[中圖分類(lèi)號(hào)] R767.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）09（b）-0025-04

宮頸癌是嚴(yán)重威脅婦女健康的常見(jiàn)惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升并呈低齡化趨勢(shì)，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是防治宮頸癌的關(guān)鍵[1]。臨床研究表明，從宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）、到宮頸原位癌、浸潤(rùn)癌是逐漸遞進(jìn)的病變惡化過(guò)程，約22%CIN Ⅲ進(jìn)展為浸潤(rùn)癌[2]，因此對(duì)于CIN進(jìn)展進(jìn)行預(yù)測(cè)十分重要。研究表明，胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ mRNA結(jié)合蛋白3（insulin-like growth factor-ⅡmRNA-binding protein 3，IMP3）是一個(gè)癌胚蛋白，表達(dá)于胰腺癌，胃癌、子宮內(nèi)膜癌等多種惡性腫瘤組織中，并和其生物學(xué)行為相關(guān)，且該基因表達(dá)量的改變還可以作為監(jiān)測(cè)腫瘤惡性行為的發(fā)展趨勢(shì) ，證實(shí)IMP3在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起了非常重要的作用，尤其是在腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移中起著更重要的作用。對(duì)于腫瘤篩查、早期診斷、預(yù)后的判斷有意義[3-6]。

微血管密度（microvessel density，MVD）測(cè)定技術(shù)為目前評(píng)價(jià)腫瘤血管生成的金標(biāo)準(zhǔn)，已經(jīng)被作為一個(gè)有意義而且獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)應(yīng)用于臨床，與腫瘤的侵襲性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及腫瘤的分級(jí)有關(guān)[7]。本課題通過(guò)研究不同宮頸組織中IMP3蛋白和MVD的變化，探索二者在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中的作用及其臨床意義，為宮頸癌的早期診斷及預(yù)后判斷提供新指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2007年7月～2013年1月于連云港市婦幼保健院進(jìn)行宮頸活檢或手術(shù)切除標(biāo)本存檔蠟塊100例，患者年齡19～73歲，術(shù)前均未行放療或者化療。其中宮頸鱗癌50例，CIN 35例，宮頸炎15例。宮頸鱗癌中，高分化16例，中分化17例，低分化17例；宮頸鱗癌分期（FIGO 2009）I期37例，Ⅱa期13例，CINⅠ11例、CIN Ⅱ12例、CIN Ⅲ12例。本研究經(jīng)連云港市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)討論后批準(zhǔn)，參與研究者均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑

鼠抗人IMP3單克隆抗體（工作濃度1∶200）購(gòu)自武漢博士德公司；CD34抗體（即用型）及其余試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物有限公司。

1.3 染色方法

采用免疫組織化學(xué)S-P法，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，抗原修復(fù)采用高壓鍋高溫修復(fù)，用已知乳腺陽(yáng)性切片做陽(yáng)性對(duì)照，用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照。具體步驟如下：切片，烤片，脫蠟，酒精梯度，自來(lái)水洗，純凈水洗1 min；高壓鍋加入檸檬酸緩沖液，燒沸（240℃），置入切片，壓力閥頂起后加熱3～5 min，熄火后自然冷卻3～5 min，自來(lái)水沖洗冷卻5 min（至鍋底冷卻）；取出切片，自來(lái)水洗，純凈水洗1 min；擦干玻片，畫(huà)圈，適當(dāng)干燥后PBS沖洗（去垢劑）2 min×3次；擦干玻片，H2O2封閉（覆蓋標(biāo)本）10 min，PBS沖洗2 min×3次；加一抗，37℃溫箱1 h后4℃冰箱過(guò)夜，PBS沖洗2 min×3次；即用型二抗10～15 min，PBS沖洗2 min×3次；DAB顯液（現(xiàn)配），鏡下觀(guān)察（約2 min），水洗終止；蘇木精染色1 min，分化、返藍(lán)、梯度酒精、封片；蘇木精復(fù)染1～2 min，自來(lái)水沖洗干凈，分別依次采用80%、95%無(wú)水乙醇的梯度脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，鏡檢。

1.4 結(jié)果判定

IMP3基因結(jié)果判定：IMP3基因主要位于細(xì)胞漿，以細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的染色定為陽(yáng)性。在400倍視野下進(jìn)行觀(guān)察，統(tǒng)計(jì)染色陽(yáng)性細(xì)胞在所觀(guān)察整個(gè)高倍視野中宮頸細(xì)胞中百分比，分為4級(jí)：染色陽(yáng)性細(xì)胞占宮頸細(xì)胞數(shù)<10%為0分，10%～30%為1分，>30%～60%為2分，>60%為3分；0分為陰性，1～3分為陽(yáng)性。染色強(qiáng)度分為陰性（無(wú)著色0分）、弱陽(yáng)性（淡黃色1分）、中等陽(yáng)性（棕黃色2分）、強(qiáng)陽(yáng)性（棕褐色3分），分別記為-、+、++、+++。將每張切片的染色強(qiáng)度得分與陽(yáng)性細(xì)胞百分率得分相乘，最后得分，0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽(yáng)性（+），4～6分為中等陽(yáng)性（++），>6分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

MVD結(jié)果判定：微血管密度的計(jì)數(shù)參照Weidner等[8]法，將CD34染色陽(yáng)性的單個(gè)內(nèi)皮或一簇內(nèi)皮細(xì)胞作為一個(gè)微血管，先在100倍鏡下選擇5個(gè)新生血管最密集區(qū)（熱區(qū)），再在400倍視野下進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)結(jié)果均有兩位研究者計(jì)數(shù)，取其均數(shù)為該病例的微血管密度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析IMP3表達(dá)與MVD的相關(guān)性，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同宮頸組織中IMP3的表達(dá)及MVD值比較

IMP3陽(yáng)性表達(dá)位于腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)，呈棕黃色顆粒（圖1A）；CIN Ⅱ～Ⅲ有3例為（+），染色較淺，散在分布于鱗狀細(xì)胞病變部（圖1B），其余陽(yáng)性表達(dá)均為（++～+++），染色較深集中分布（圖1B）；在宮頸炎性組織及CIN Ⅰ中IMP3不表達(dá)（圖1C）。Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，IMP3陽(yáng)性表達(dá)與宮頸病變程度呈正相關(guān)（r = 0.537，P < 0.01）；隨著宮頸病變加重，不同宮頸組織中MVD值升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=145.968，P < 0.01），組間兩兩比較，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 IMP3表達(dá)及MVD值與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

IMP3陽(yáng)性表達(dá)率和MVD值與宮頸鱗癌臨床分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肌層浸潤(rùn)深度有關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01），IMP3陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤大小無(wú)關(guān)（P > 0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 IMP3表達(dá)與MVD值在宮頸癌組織中的相關(guān)性分析

50例宮頸癌組織中IMP3陽(yáng)性表達(dá)的患者為43例，陰性表達(dá)為7例。宮頸癌組織中，IMP3陽(yáng)性表達(dá)與MVD 值呈正相關(guān)（r=0.323，P < 0.05）。

3 討論

3.1 IMP3在不同宮頸組織中表達(dá)及臨床意義

CIN為一組與宮頸浸潤(rùn)癌密切相關(guān)癌前病變，反映宮頸浸潤(rùn)癌發(fā)生發(fā)展中連續(xù)的過(guò)程，其變化具有漸進(jìn)性 ，并處于動(dòng)態(tài)變化中 。CIN具有三種自然轉(zhuǎn)歸，消退、持續(xù)不變或進(jìn)展為更高級(jí)別的病變，更嚴(yán)重發(fā)展為浸潤(rùn)癌。級(jí)別越高 ，其消退的機(jī)會(huì)就越小[2]，因此積極尋找及早發(fā)現(xiàn)癌前病變及預(yù)測(cè)其發(fā)展顯得格外重要。IMP3基因是一種新識(shí)別的RNA結(jié)合蛋白，生長(zhǎng)因子信使RNA結(jié)合蛋白之一，該基因定位于染色體7p11.5，包含580個(gè)氨基酸的殘基，被4350個(gè)核苷酸mRNA轉(zhuǎn)錄所編碼。研究發(fā)現(xiàn)，在早期胚胎形成時(shí)期，IMP3基因在上皮組織，肌肉組織和胎盤(pán)組織中均有表達(dá)，但在成人組織中卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。在胚胎的形成時(shí)期，IMP3基因在結(jié)合，轉(zhuǎn)錄，穩(wěn)定胚胎胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅱ（IGF-Ⅱ）過(guò)程中起著重要的作用。IMP3可間接調(diào)控IGF-Ⅱ基因表達(dá)，而IGF-Ⅱ通過(guò)激活和結(jié)合IGF-Ⅰ受體使酪氨酸激酶氧化磷酸化，氧化磷酸化的IGF-Ⅰ受體再將傳導(dǎo)促有絲分裂的信號(hào)傳到細(xì)胞內(nèi)，參與腫瘤的形成過(guò)程，促進(jìn)腫瘤的細(xì)胞增生[9-13]。

本研究結(jié)果顯示，IMP3陽(yáng)性表達(dá)率在宮頸正常組織、CINL組織、CINH、宮頸鱗癌組織，隨著病變程度加重呈遞增趨勢(shì)，和宮頸鱗癌的連續(xù)發(fā)展是相符的，兩者具有相關(guān)性，且各組兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IMP3在CIN Ⅱ～Ⅲ中，而在宮頸炎性組織和低級(jí)別病變的宮頸組織中不表達(dá)，Lu等[14]的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)在宮頸切除術(shù)后隨訪(fǎng)中，僅在IMP3陽(yáng)性的CIN Ⅱ～Ⅲ患者中發(fā)現(xiàn)了浸潤(rùn)癌，而在IMP3陰性的CIN Ⅱ～Ⅲ患者中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)浸潤(rùn)癌，兩者比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。IMP3在宮頸細(xì)胞從增生發(fā)展為侵襲性宮頸鱗癌過(guò)程中起重要作用。IMP3可以用于確定有發(fā)展為侵襲性宮頸鱗癌風(fēng)險(xiǎn)的初步判斷。IMP3可以作為預(yù)測(cè)CIN患者進(jìn)展為浸潤(rùn)癌的理想的分子檢測(cè)標(biāo)志，IMP3陽(yáng)性表達(dá)患者應(yīng)嚴(yán)密隨訪(fǎng)，無(wú)生育要求的患者可考慮切除子宮。

本實(shí)驗(yàn)探討了IMP3表達(dá)與宮頸癌的幾個(gè)重要預(yù)后因素的關(guān)系，顯示其表達(dá)與宮頸鱗癌臨床分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)深度、腫瘤分化程度有關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），IMP3表達(dá)陽(yáng)性顯示疾病預(yù)后不良，與林黎娟等[15]研究報(bào)道的IMP3在肝癌組織中的表達(dá)與肝癌的組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)及生存率相關(guān)是一致的，提示其可能參與細(xì)胞生長(zhǎng)分化侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)程，可作為判斷腫瘤惡性程度及預(yù)后的指標(biāo)。目前研究顯示IMP3可能通過(guò)調(diào)節(jié)控制CD44的表達(dá)，減低細(xì)胞的黏附，降解Ⅳ型膠原纖維，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲，另外IMP3基因還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子（ALCAM、SynCAM、MCAM）、CD24和基質(zhì)金屬蛋白酶1等的表達(dá)，而這些分子均與細(xì)胞的黏附和腫瘤的侵襲性有關(guān)系[16]。

3.2 MVD在不同宮頸組織中表達(dá)意義

研究發(fā)現(xiàn)微血管與惡性腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移成密切相關(guān)，其數(shù)量被認(rèn)為預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的一項(xiàng)重要指標(biāo)[17]。本研究采用特異性CD34抗體標(biāo)記組織中血管內(nèi)MVD值，發(fā)現(xiàn)隨著宮頸病變程度的加重，MVD值升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），在宮頸鱗癌中，和腫瘤的分化程度、臨床分期、肌層浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小均有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01），提示微血管的形成可能促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)及侵襲，進(jìn)一步證實(shí)血管生成對(duì)于評(píng)估患者的預(yù)后疾病的發(fā)展有重要價(jià)值。宮頸鱗癌組織中MVD值升高提示宮頸癌具有高危因素及預(yù)后不良。

3.3 IMP3及MVD檢測(cè)的意義

本研究顯示IMP3表達(dá)和MVD的表達(dá)呈正相關(guān)，在宮頸鱗癌組織中，MVD計(jì)數(shù)隨臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移、進(jìn)展明顯升高，隨著MVD值升高，IMP3陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高（r = 0.323，P < 0.05）。有研究表明，IGF-Ⅱ可通過(guò)促進(jìn)表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）的產(chǎn)生，加強(qiáng)VEGF促腫瘤血管形成[18]。VEGF是目前已知作用最強(qiáng)的促血管生成因子，能特異性地直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管形成[18-20]，提示IMP3可能通過(guò)增強(qiáng)IGF-Ⅱ表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，進(jìn)而微血管形成，從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)及侵襲。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IMP3蛋白可能成為可以作為預(yù)測(cè)CIN進(jìn)展為浸潤(rùn)癌的理想的分子檢測(cè)標(biāo)志。MVD是一個(gè)評(píng)估腫瘤血管生成及反映臨床疾病進(jìn)展的可靠參數(shù)。聯(lián)合檢測(cè)IMP3及MVD是判斷宮頸癌患者預(yù)后的新的指標(biāo)及腫瘤治療的新的靶點(diǎn)，對(duì)于IMP3及MVD的深入研究有利于進(jìn)一步了解腫瘤的生物學(xué)行為，為宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)及治療提供新的思路。

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（收稿日期：2015-05-29 本文編輯：任 念）