王夢(mèng)龍 萬 軍

武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北武漢 430060

越來越多的證據(jù)顯示，活性氧（reactive oxygen species，ROS） 生成增多引起的氧化應(yīng)激參與了多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[1]，而臨床抗氧化應(yīng)激試驗(yàn)（補(bǔ)充抗氧化劑維生素）的失敗說明氧化應(yīng)激與心血管疾病之間可能存在更為復(fù)雜的關(guān)系[2-3]。 正常情況下ROS通過激活不同的信號(hào)途徑維持細(xì)胞的生理功能，如細(xì)胞增殖、分化和遷移等；而病理情況下，高水平的ROS導(dǎo)致細(xì)胞功能的紊亂和疾病的發(fā)生?，F(xiàn)有的研究提示ROS 的作用高度依賴于ROS 的來源、存在的部位、局部濃度，甚至與ROS 種類相關(guān)[4]。心臟和血管組織ROS有以下幾種來源：線粒體電子傳遞鏈、黃嘌呤氧化酶、解偶聯(lián)的內(nèi)皮一氧化氮合酶和NADPH 氧化酶（NADPH oxidase，Nox）[5]。Nox 是一類以生成ROS 為主要功能的蛋白質(zhì)，明確Nox 在常見心血管疾病中的表達(dá)及其作用對(duì)臨床抗氧化治療的實(shí)施具有重要意義。

1 NADPH 氧化酶家族概述

Nox2 是最早發(fā)現(xiàn)的Nox 亞型，能夠?qū)ADPH 的電子傳遞給分子氧，生成超氧陰離子（O2-）[6]。 Nox2 表達(dá)于細(xì)胞膜，由胞膜亞基Nox2（gp91phox）、p22phox和胞漿亞基p40phox、p47phox、p67phox、Rac1 組成， 生理狀態(tài)下不具有活性，其活化需要胞漿亞基相互結(jié)合并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜。 與Nox2 不同，Nox4 主要表達(dá)于核膜周圍，包括細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等，處于持續(xù)激活狀態(tài)，不具有胞漿亞基， 其活性的調(diào)節(jié)主要依賴Nox4 mRNA或蛋白水平的變化， 且Nox4 激活后主要產(chǎn)生過氧化氫（H2O2），而非O2-[6]。目前共發(fā)現(xiàn)7 種Nox 亞型：Nox1～5 和雙氧合酶1、2， 心血管系統(tǒng)中主要表達(dá)Nox1、Nox2、Nox4 和Nox5，這些亞型在心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞中均有表達(dá)，其中心肌細(xì)胞主要表達(dá)Nox2 和Nox4[7]。

2 NADPH 氧化酶在常見心血管疾病中的作用

2.1 心肌肥厚與心力衰竭

研究證實(shí)Nox 活性增高是心衰患者心肌ROS 生成增多的主要原因[8-10]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)心衰時(shí)Nox4、Nox2 及Nox2 亞基mRNA 水平無明顯變化，其活性的增加可能與Nox2 亞基p47phox由胞漿向胞膜轉(zhuǎn)移增加引起[9-10]。 同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)Nox 活性的增加與引起心衰的病因無關(guān)，在擴(kuò)張型心肌病和缺血性心肌病患者心肌中，Nox 活性相似[11]。

心肌肥厚是心力衰竭過程中重要的病理生理改變。研究發(fā)現(xiàn)，Nox2 活性在血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ） 引起的小鼠心肌肥厚模型中增高， 敲除Nox2 可以降低AngⅡ誘導(dǎo)的左室肥厚程度，同時(shí)心肌肥厚標(biāo)志物如ANP、β-MHC 等水平下降[12]。 敲除Nox2的活性調(diào)節(jié)分子Rac1 得到類似的結(jié)果[13]，提示Nox2在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥厚中起重要作用。 Nox2 發(fā)揮作用的機(jī)制可能與ERK1/2、AKT、ASK1/NF-κB 活性的改變有關(guān)[13-15]。隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)在主動(dòng)脈縮窄術(shù)誘導(dǎo)的心肌肥厚模型中， 敲除Nox2 的小鼠和野生型小鼠出現(xiàn)同等程度的心肌肥厚[16]，提示Nox的功能可能具有亞型特異性，Nox2 僅在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥厚中起作用，而并不參與壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚。 在Nox2 敲除小鼠中，壓力負(fù)荷可引起Nox4水平代償性的增高[16]，這可能是Nox2 在壓力負(fù)荷模型中不起作用的原因之一。

Nox4 在壓力負(fù)荷心肌肥厚模型中起何種作用，結(jié)論尚不統(tǒng)一。 有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Nox4 敲除小鼠在壓力負(fù)荷模型中出現(xiàn)更嚴(yán)重的左室肥厚和左室收縮功能障礙，伴有心室的擴(kuò)張，而過表達(dá)Nox4 出現(xiàn)相反的心臟表型，說明Nox4 在心肌肥厚時(shí)起保護(hù)作用[17]。 缺氧誘導(dǎo)因子Hif1α 的上調(diào)可能參與了Nox4 對(duì)壓力負(fù)荷模型的保護(hù)作用， 但Nox4 通過何種途徑上調(diào)Hif1α 尚需進(jìn)一步研究[17]。 而Sadoshima 實(shí)驗(yàn)室的研究卻得出相反的結(jié)論， 即Nox4 在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚模型中起損害作用[8]。 兩個(gè)研究得出不同結(jié)論的原因尚不清楚，推測(cè)與小鼠遺傳背景、基因敲除或過表達(dá)技術(shù)的不同以及心肌肥厚嚴(yán)重程度相關(guān)。

2.2 冠狀動(dòng)脈粥樣硬化和心肌梗死

ROS 可以將低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）氧化成ox-LDL 并在內(nèi)皮下沉積，促進(jìn)粥樣斑塊的形成。 同時(shí)ROS 還可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞遷移、增殖和凋亡，進(jìn)而引起冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能障礙[18]。 在人心臟冠脈血管， 非粥樣斑塊區(qū)域血管內(nèi)膜、 中膜和外膜ROS 生成量基本一致，而在粥樣斑塊區(qū)域，因巨噬細(xì)胞聚集，ROS 生成明顯增多。 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)Nox2及其亞基p22phox主要定位于巨噬細(xì)胞， 而Nox4 主要在非巨噬細(xì)胞， 且Nox2、p22phoxmRNA 含量與粥樣斑塊嚴(yán)重程度相關(guān)[19]。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)Nox 活性增加促進(jìn)高脂飲食引起的動(dòng)脈粥樣硬化，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練或轉(zhuǎn)變?yōu)檎ｏ嬍晨梢越档蚇ox 活性和ERK1/2、JNK 磷酸化水平，從而逆轉(zhuǎn)動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)危險(xiǎn)因素[20]。 不穩(wěn)定斑塊與急性冠脈綜合征的發(fā)生密切相關(guān)，氧化應(yīng)激水平的增加促進(jìn)斑塊成分的改變和斑塊的進(jìn)展，導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定。 近期研究發(fā)現(xiàn)斑塊內(nèi)Nox4 水平的增加可促進(jìn)斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變，引起斑塊不穩(wěn)定和斑塊破裂，從而導(dǎo)致心肌梗死的發(fā)生[21]。

通過免疫組化和Western Blot 技術(shù)，研究者發(fā)現(xiàn)急性心梗后， 梗死區(qū)和梗死周邊區(qū)心肌細(xì)胞Nox2 表達(dá)明顯增加， 而遠(yuǎn)離心梗部位心肌細(xì)胞Nox2 含量并無明顯變化，提示Nox2 生成的ROS 可能參與心梗的發(fā)生[22]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)在心肌梗死后心肌細(xì)胞Nox2和Nox4 表達(dá)增高[23-24]，抑制Nox2 或Nox4 不減少心肌梗死面積，但可以減輕心室擴(kuò)張程度，同時(shí)改善收縮功能，大幅提高小鼠存活率[24-27]，說明Nox 是干預(yù)心肌梗死后心肌重構(gòu)的重要靶點(diǎn)。 但目前對(duì)于Nox2 和Nox4 在心肌缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損傷時(shí)的亞型特異性作用了解甚少。 全身性敲除Nox2與Nox4 小鼠在I/R 損傷時(shí)出現(xiàn)相似的表型：I/R 損傷后，心肌ROS 水平和梗死面積基本一致[28]，提示定位于細(xì)胞不同部位的Nox2 和Nox4 產(chǎn)生的ROS 在I/R損傷時(shí)的作用相似。 盡管Nox2 生成的主要是O2-，但在超氧歧化酶作用下，O2-很快歧化生成H2O2，而H2O2具有很高的膜通透性，這可能是Nox2 與Nox4 在I/R損傷時(shí)作用相似的原因。 另外，心臟特異性敲除Nox4小鼠在I/R 刺激時(shí)出現(xiàn)與全身性Nox4 敲除小鼠同等程度的心肌損傷，說明心肌細(xì)胞中的Nox4，而非其他細(xì)胞來源（如巨噬細(xì)胞）的Nox4，參與了I/R 損傷時(shí)心肌細(xì)胞功能的改變[28]。一定水平的ROS 對(duì)心肌細(xì)胞正常生理功能的維持和心肌損傷時(shí)的適應(yīng)性反應(yīng)是必需的。心肌特異性過表達(dá)負(fù)向調(diào)控Nox 小鼠可以抑制所有Nox 亞型， 該小鼠與雙敲除Nox2 和Nox4 的小鼠在受到I/R 損傷時(shí)， 盡管ROS 水平比單獨(dú)敲除Nox2 或Nox4 小鼠更低，心肌梗死面積反而更大[28]。

2.3 心律失常

心房顫動(dòng)（atrial fibrillation，AF）是臨床上常見的一種心律失常，心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)與電重構(gòu)在AF 的誘發(fā)和維持中起重要作用。現(xiàn)有證據(jù)表明心房氧化應(yīng)激途徑在AF 病理生理過程中起重要作用[29-30]。 AF 患者心耳組織Nox 活性增加，ROS 生成增多， 通過調(diào)節(jié)肺靜脈和心房細(xì)胞的電活動(dòng)， 引起異位起搏點(diǎn)活性增加，導(dǎo)致AF 發(fā)生[31]。 Nox 活性在陣發(fā)性房顫和永久性房顫患者心耳組織中并無明顯不同，Real-time PCR 結(jié)果也證實(shí)Nox2 mRNA 水平在兩種患者心耳組織中表達(dá)量相似[32]。 但目前尚無統(tǒng)一結(jié)論說明何種Nox 亞型在AF 患者Nox 活性調(diào)節(jié)中起主要作用。 Zhang 等[31]的研究提示AF 患者左心耳Nox4 mRNA 水平增加，與心耳組織H2O2水平正相關(guān)。 而Kim 等[33]并未在AF患者右心耳組織中檢測(cè)到Nox4 的表達(dá)。 在對(duì)Nox 參與AF 的機(jī)制探討中， 研究者發(fā)現(xiàn)Nox2 可以激活蛋白激酶A（proteinkinase A，PKA）和鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent kinaseⅡ,CaMKⅡ)， 活化的PKA 可以導(dǎo)致鈉電流和鈣電流的紊亂；同時(shí)活化的CaMKⅡ增加肌漿網(wǎng)Ca2+外漏，通過這兩種不同的途徑參與了AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞早期后除極[34-35]。

2.4 高血壓病

研究發(fā)現(xiàn)Nox 同樣是血管系統(tǒng)ROS 的主要來源。 病理因素刺激時(shí)，Nox 被激活，產(chǎn)生大量的ROS，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能的紊亂和疾病的發(fā)生。 Nox 生成的O2-很快歧化生成具有高度膜通透性的H2O2， 而H2O2是重要的血管舒張因子， 因此過表達(dá)Nox4 可以增加內(nèi)皮依賴性血管舒張作用[36]。 此外，H2O2還可以增加內(nèi)皮一氧化氮合酶的表達(dá)與活性，從而促進(jìn)血管舒張因子一氧化氮的合成[37]。

高血壓病是一種復(fù)雜的、具有多種調(diào)控因素的疾病，高血壓病患者血管Nox 表達(dá)水平尚不清楚，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)自發(fā)性高血壓大鼠主動(dòng)脈Nox4 表達(dá)下降[38]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，與血壓正常大鼠相比，自發(fā)性高血壓大鼠基底動(dòng)脈Nox4 mRNA 水平升高4.1 倍[39]，這些結(jié)果提示Nox 在高血壓病血管中的表達(dá)可能與血管部位相關(guān)。 Nox 在高血壓病中的作用在AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓模型中得到充分證實(shí)。Nox1 或Nox2 缺失小鼠在AngⅡ刺激時(shí)不會(huì)出現(xiàn)血壓升高[40-41]，而平滑肌特異性過表達(dá)Nox1 或內(nèi)皮特異性過表達(dá)Nox2 小鼠在AngⅡ刺激時(shí)血壓升高更為顯著[42-44]。然而，內(nèi)皮特異性過表達(dá)Nox4 卻可以導(dǎo)致小鼠基礎(chǔ)血壓的下降， 可能與過表達(dá)Nox4 導(dǎo)致H2O2含量大幅升高、內(nèi)皮依賴性血管舒張作用增強(qiáng)有關(guān)[36]。 不同Nox 在高血壓病中作用不同可能與其生成的ROS 類型不同有關(guān)[45]，Nox1 或Nox2 主要生成O2-，而Nox4 主要生產(chǎn)H2O2。 另外，有證據(jù)表明大腦的Nox 參與了AngⅡ誘導(dǎo)的血壓反應(yīng)。下調(diào)大腦Nox 水平可以降低全身性或大腦局部AngⅡ處理引起的血壓升高[46-47]。 盡管關(guān)于Nox 在高血壓病中作用的研究大部分是在AngⅡ模型中完成，有少量研究表明Nox 參與了腎性高血壓的形成。在Nox 缺失的小鼠中，醋酸脫氧皮質(zhì)酮高鹽不能誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)高血壓模型[48-49]。進(jìn)一步分析其原因發(fā)現(xiàn)，腎小球致密斑表達(dá)Nox 蛋白，可能參與了球-管反饋，進(jìn)而參與高血壓的形成。

3 小結(jié)與展望

利用NADPH 的電子生成ROS 是Nox 的唯一作用，而Nox 復(fù)雜的激活和活性調(diào)節(jié)過程以及下游不同的信號(hào)途徑提供了多種干預(yù)病理生理過程的靶點(diǎn)。通過探討Nox 在常見心血管疾病中的表達(dá)與作用可以發(fā)現(xiàn)，Nox 在病理生理過程中的作用很大程度上取決于活化的Nox 亞型及其表達(dá)水平。目前對(duì)于Nox 的亞型特異性作用研究尚不充分，同時(shí)尚未開發(fā)出針對(duì)不同Nox 亞型的特異性抑制劑[50]。ROS 在病理生理過程中的“雙刃劍”作用增加了臨床抗氧化治療的難度，因此需要更多的研究明確不同Nox 亞型的作用，并開發(fā)出Nox 亞型特異性抑制劑，從而更好地開展臨床抗氧化治療。

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