郭尚函， 林炎龍， 趙倉(cāng)煥， 何華香， 王 妤

(暨南大學(xué)1.醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，廣東廣州510632;2.附屬第一醫(yī)院 針灸科，廣東廣州510630)

失眠癥(Insomnia)，主要指以睡眠時(shí)間長(zhǎng)度和睡眠深度不足為特征的一種病癥［1］.睡眠和免疫功能關(guān)系密切，長(zhǎng)時(shí)間的失眠可以影響免疫功能而導(dǎo)致疾病的發(fā)生，甚至死亡［2］.多種和免疫功能相關(guān)疾病比如感染、惡性腫瘤、抑郁癥等均與睡眠剝奪有關(guān)［3］.目前耳穴療法在臨床上已被廣泛應(yīng)用于治療失眠癥，對(duì)其機(jī)制的研究多以調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)［4］、循環(huán)系統(tǒng)功能［5］以及恢復(fù)重建紊亂的生物鐘［6］為主，耳穴治療失眠癥是否能調(diào)節(jié)失眠患者的免疫功能，其作用機(jī)理尚不清楚.

Toll樣受體4(Toll-like receptors，TLR4)可識(shí)別革蘭氏陰性菌的脂多糖(lipopo-lysaccharide，LPS)［7］，通過(guò)一系列信號(hào)傳導(dǎo)，最終引起細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子、I型干擾素、趨化因子和抗菌肽等相關(guān)因子［8］，激活天然免疫系統(tǒng)，在天然免疫反應(yīng)中有著關(guān)鍵性的作用.TLR4表達(dá)適度時(shí)，可啟動(dòng)機(jī)體防御功能，但過(guò)度表達(dá)時(shí)，則可引起相關(guān)的炎癥性疾病，許多臨床疾病如腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、牙周病等與之緊密聯(lián)系.本研究觀察耳穴貼壓對(duì)睡眠剝奪大鼠脾臟TLR4信號(hào)通路關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)的影響，探討其治療作用的機(jī)理，為臨床使用耳穴貼壓治療失眠癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

(1)動(dòng)物與分組 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠32只，體質(zhì)量(250±20)g，由中山大學(xué)(大學(xué)城)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，醫(yī)學(xué)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK＜粵 ＞20011 －0029，NO.44008500002592.

將32只大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、安定組、耳穴貼壓組，每組8只，正常飼養(yǎng)7 d后予以相應(yīng)處理.實(shí)驗(yàn)均在每天上午7:00～11:00之間進(jìn)行，環(huán)境要求安靜、通風(fēng)、室溫26℃左右.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處理均遵照“關(guān)于善待動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)”.

(2)主要試劑及儀器 PCPA(para-chlorophenylalanine)購(gòu)自美國(guó)sigma公司;地西伴(安定)注射液購(gòu)自天津金耀氨基酸有限公司;RnaEx與ddH2O購(gòu)自上海杰瑞生物工程有限公司;Quant cDNA第一鏈合成試劑盒與SYBR Green熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司.

XS-100A耳穴探測(cè)儀為南京小松醫(yī)療儀器研究所產(chǎn)品;YP601N型電子天平為上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;超凈工作臺(tái)為蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品;5840R水平低溫離心機(jī)為德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品;－80℃低溫冰箱、可調(diào)式移液器與微量核酸分光光度計(jì)ND-1000均為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品;PCT-200型梯度PCR儀、48孔CFX Manager實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、EP管與PCR八連管均為美國(guó)BIORAD公司產(chǎn)品.

1.2 方法

(1)造模及處理方法 對(duì)照組:不造模，與模型組同期飼養(yǎng)，未進(jìn)行任何處理的大鼠.實(shí)驗(yàn)第8天安靜狀態(tài)下取材.模型組:于實(shí)驗(yàn)第l天開(kāi)始造模，第8天上午8:30～9:00安靜狀態(tài)下取材，將PCPA用弱堿性生理鹽水配置成質(zhì)量濃度為20 g/L的混懸液，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45 mg/100 g進(jìn)行腹腔注射，于實(shí)驗(yàn)的第1、2天各注射1次;安定組:于實(shí)驗(yàn)第3天開(kāi)始每天上午8:00～8:30分別用安定注射液腹腔注射，連續(xù)7 d，按成人催眠劑量每天10 mg，用人鼠給藥劑量體表面積折算公式計(jì)算出大鼠給藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.92 mg/kg，每日1次，其他同模型組.耳穴貼壓組:于實(shí)驗(yàn)第3日開(kāi)始每天上午8:00～8:30及晚上20:00～20:30予兩側(cè)耳朵消毒并用磁珠貼壓耳穴，預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)每次貼壓耳穴磁珠保留的時(shí)間約為4 h，每日2次，其他同模型組.耳穴取穴及貼壓方法:按文獻(xiàn)［9］，結(jié)合動(dòng)物穴位具有相對(duì)特異性的特點(diǎn)［10］，以動(dòng)物比較學(xué)方法確定穴位出現(xiàn)可能區(qū)域，再借助經(jīng)穴探測(cè)儀器進(jìn)行輔助定穴，按壓力量以大鼠有躲避傾向等痛覺(jué)反應(yīng)為度.

(2)觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠禁食過(guò)夜，用腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠.切取其脾臟，冰上分離脂肪等雜質(zhì)，稱體質(zhì)量，脾臟迅速放入液氮冷凍，再在－80℃冰箱保存，準(zhǔn)備提取RNA.取適量樣本組織 50～100 mg，剪碎研磨至粉末，裝入無(wú)酶 EP管，加 1 mL RnaEx總RNA提取試劑，充分勻漿后，室溫靜置5 min.4℃，12 000 r/min 離心 10 min.取上清，加入0.2 mL體積的氯仿，震蕩混勻，室溫靜置5 min.4℃，12 000 r/min離心15 min.取上清，加入0.5 mL異丙醇，輕輕上下顛倒幾次，混勻，室溫靜置10 min.4℃，12 000 r/min離心10 min.棄上清，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為75% 的乙醇，輕輕顛倒幾次.4℃，7 500 r/min離心5 min.棄上清，室溫干燥5 min，加入適量ddH2O溶解RNA沉淀，20 μL反應(yīng)液分裝備用.將提取好的反應(yīng)液用微量核酸分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度及濃度，確保OD260/OD280比值在1.8～2.2之間.按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將20 μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系于37°C 60 min終止反應(yīng)，合成cDNA.

TLR4上游引物:5'-GACTTTAACTACCAACAGAGAGGAT-3'，下游引物:5'-AAATCAGAATAAGAACAGCAACC-3'，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物120 bp;MyD88上游引物:5'-ATTGAGAAAAGGTGTCGTCGCAT-3'，下游引物:5'-TCGCAGATAGTGATGAACCGTAGG-3'，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 191 bp;IRAK1上游引物:5'-CCAGTGGAGAGTGATGAGAGTGTTC-3'，下游引物:5'-TTCTCTGGTAGTGCCTCCTTGTGTA-3'，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物132 bp;TRAF6上游引物:5'-GAGAGATTCTTTCCCTGACGGTA-3'，下游引物:5'-TTGGGGACAAATCACTAGAGCG-3'，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 119 bp;NF-κB 上游引物:5'-GGATGGCTTCTATGAGGCTGA-3'，下游引物:5'-CTTGAAAGGGGTTATTGTTGGTC-3'，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物140 bp;TRIF上游引物:5'-ATTCAGTAAGGAGCAGTAATAGGA-3'，下游引物:5'-TTGACTCTTGACATAAGGGACACT-3'，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物120 bp;內(nèi)參 β-actin上游引物:5'-CTGAACCCTAAGGCCAACCG-3'，下游引物:5'-GACCAGAGGCATACAGGGACAA-3'，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 112 bp.取 2 μL cDNA按一定組份在冰上配制PCR反應(yīng)液，將引物與反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在20 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR擴(kuò)增條件:起始模板95℃預(yù)變性2 min，95℃變性 15 s，58℃退火20 s，68℃延伸30 s，39 個(gè)循環(huán).反應(yīng)結(jié)束后，采用Opticon Monitor 3.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，公式 2－ΔΔCt進(jìn)行相對(duì)定量.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

圖1 各組大鼠脾臟TLR4信號(hào)通路關(guān)鍵基因的表達(dá)結(jié)果Fig.1 The results of the TLR4 signaling pathway key genes expression in rats'spleen of each group

表1 各組大鼠脾臟TLR4基因的表達(dá)結(jié)果Table 1 The results of TLR4 gene expression in rats′spleen of each group

表1 各組大鼠脾臟TLR4基因的表達(dá)結(jié)果Table 1 The results of TLR4 gene expression in rats′spleen of each group

1)與模型組比較，P＜0.05.

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表2 各組大鼠脾臟MyD88基因的表達(dá)結(jié)果Table 2 The results of MyD88 gene expression in rats′spleen of each group

表2 各組大鼠脾臟MyD88基因的表達(dá)結(jié)果Table 2 The results of MyD88 gene expression in rats′spleen of each group

模型組、安定組和耳貼組兩兩比較，P＞0.05.

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表3 各組大鼠脾臟IRAK1基因的表達(dá)結(jié)果)Table 3 The results of IRAK1 gene expression in rats′spleen of each group

表3 各組大鼠脾臟IRAK1基因的表達(dá)結(jié)果)Table 3 The results of IRAK1 gene expression in rats′spleen of each group

1)與模型組比較P＜0.05.

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表4 各組大鼠脾臟TRAF6基因的表達(dá)結(jié)果Table 4 The results of TRAF6 gene expression in rats′spleen of each group

表4 各組大鼠脾臟TRAF6基因的表達(dá)結(jié)果Table 4 The results of TRAF6 gene expression in rats′spleen of each group

1)與模型組比較，P＜0.05.

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表5 各組大鼠脾臟NF-κB基因的表達(dá)結(jié)果Table 5 The results of NF-κB gene expression in rats′spleen of each group

表5 各組大鼠脾臟NF-κB基因的表達(dá)結(jié)果Table 5 The results of NF-κB gene expression in rats′spleen of each group

1)與模型組比較，P＜0.05.

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表6 各組大鼠脾臟TRIF基因的表達(dá)結(jié)果Table 6 The results of TRIF gene expression in rats′spleen of each group

表6 各組大鼠脾臟TRIF基因的表達(dá)結(jié)果Table 6 The results of TRIF gene expression in rats′spleen of each group

1)與模型組比較，P＜0.05.

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與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠脾組織 TLR4、IRAK1、TRAF6、NF-κB 和 TRIF 的 mRNA 表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05);與模型組比較，耳貼組和安定組大鼠TLR4信號(hào)通路關(guān)鍵基因表達(dá)水平均有不同程度下調(diào)(P＜0.05)，提示睡眠剝奪影響大鼠機(jī)體免疫功能與TLR4信號(hào)通路關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)水平上調(diào)有關(guān)，耳穴貼壓可能是通過(guò)下調(diào)TLR4信號(hào)通路關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)水平，抑制炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6的釋放發(fā)揮調(diào)整機(jī)體免疫功能并間接改善機(jī)體睡眠的作用.

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠脾組織MyD88 mRNA表達(dá)水平未見(jiàn)顯著升高(P＞0.05);與模型組比較，耳貼組和安定組大鼠MyD88 mRNA表達(dá)水平雖有下調(diào)趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，提示睡眠剝奪引起的大鼠免疫功能變化與MyD88的表達(dá)水平關(guān)系不大，可能是通過(guò)非MyD88依賴的信號(hào)通路起主要作用.

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠脾組織TLR4 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)，耳貼組和安定組大鼠TLR4 mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，提示耳穴貼壓可能調(diào)整且抑制TLR4 mRNA的表達(dá)，減少因睡眠剝奪而引起的炎癥細(xì)胞因子的釋放，而發(fā)揮治療失眠癥的作用.

大鼠經(jīng)連續(xù)兩天腹腔注射PCPA后，晝夜節(jié)律消失，白天異常興奮、攻擊性強(qiáng)，幾乎達(dá)到了完全的睡眠剝奪狀態(tài)，與未注射PCPA的對(duì)照組形成鮮明對(duì)比，其行為學(xué)表現(xiàn)與以往的文獻(xiàn)報(bào)道相符，證明造模成功.經(jīng)耳穴貼壓治療后，其行為、飲食、睡眠等逐漸恢復(fù)至正常.

3 討論

睡眠是機(jī)體恢復(fù)體力和腦力必不可少的過(guò)程.研究表明，睡眠剝奪可引起人的工作能力、認(rèn)知功能及情緒下降［11］.有研究表明，睡眠剝奪可對(duì)機(jī)體淋巴細(xì)胞產(chǎn)生影響.抑制ConA、LPS誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖反應(yīng)［12］;降低外周血淋巴細(xì)胞對(duì)有絲分裂刺激的增殖［13］;減少 T 細(xì)胞亞群［14－15］等等.睡眠剝奪可對(duì)NK細(xì)胞產(chǎn)生影響.Ozturk等［16］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪可導(dǎo)致NK細(xì)胞數(shù)目降低，在睡眠恢復(fù)后可逐漸回升至原有水平.睡眠剝奪還有可能對(duì)免疫球蛋白產(chǎn)生一定的影響，盡管目前對(duì)睡眠剝奪是否能引起免疫球蛋白變化的研究結(jié)果不是很明確［13－16］.睡眠剝奪可對(duì)細(xì)胞因子產(chǎn)生影響.吳興曲等［17－18］相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪后 IL-2、IL-6、TNF-α 和皮質(zhì)醇等細(xì)胞因子水平升高，這可能與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān).由此，失眠對(duì)機(jī)體免疫功能存在影響，本實(shí)驗(yàn)中，睡眠剝奪造成TLR4信號(hào)通路關(guān)鍵基因表達(dá)水平上升，反映了睡眠剝奪對(duì)機(jī)體免疫功能的影響，與相關(guān)報(bào)道相一致.

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)睡眠剝奪，大鼠脾組織TLR4 信號(hào)通路關(guān)鍵基因 TLR4、IRAK1、TRAF6、NF-κB和TRIF的mRNA表達(dá)水平升高1倍;而經(jīng)過(guò)耳貼和安定干預(yù)后的大鼠這些TLR4信號(hào)通路關(guān)鍵基因表達(dá)水平均有不同程度下調(diào)至正常水平上下，說(shuō)明睡眠剝奪可能通過(guò)上調(diào)TLR4信號(hào)通路關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)水平影響大鼠機(jī)體免疫功能，耳穴貼壓治療失眠癥的作用可能與下調(diào)TLR4信號(hào)通路關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)水平有關(guān)，可能是通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞因子如 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8 的釋放而發(fā)揮調(diào)整機(jī)體免疫功能［19－21］，并間接改善機(jī)體睡眠的作用.其中，TLR4的表達(dá)水平通過(guò)治療只有正常水平的一半，提示耳穴貼壓可能不但可以調(diào)整而且還可以抑制TLR4 mRNA的表達(dá).另外，睡眠剝奪大鼠脾組織MyD88的mRNA表達(dá)水平未見(jiàn)與其它相關(guān)基因的顯著升高，耳貼和安定治療也未對(duì)大鼠MyD88的mRNA表達(dá)水平有明顯影響，可能提示睡眠剝奪引起的大鼠免疫功能變化與MyD88的表達(dá)水平關(guān)系不大，可能是通過(guò)非MyD88依賴的信號(hào)通路起主要作用.

結(jié)合考慮臨床實(shí)際情況，耳穴療法具有簡(jiǎn)便、廉價(jià)、療效顯著、無(wú)副作用等優(yōu)點(diǎn)，又可以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，在失眠癥的預(yù)防和早期治中可作為首選治療療法，對(duì)于較嚴(yán)重的失眠癥可作為針刺或藥物等治療的輔助手段.

本實(shí)驗(yàn)所取的穴位比較單一，睡眠剝奪的時(shí)間也比較短，若延長(zhǎng)睡眠剝奪及治療的時(shí)間，可能會(huì)有更好的效果;可考慮選擇其他免疫相關(guān)信號(hào)通路或其他免疫相關(guān)指標(biāo)TLR7、脾增殖、NK細(xì)胞及細(xì)胞因子等進(jìn)行更深入的研究.

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