何 兵， 鄭少斌， 陳響秋， 鐘 締， 張輝見(jiàn)

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院泌尿外科，廣東廣州510515)

膀胱癌是我國(guó)最常見(jiàn)的泌尿系腫瘤疾病.對(duì)于肌層浸潤(rùn)型膀胱癌患者，除部分選擇性病例，原則上首先考慮根治性膀胱切除術(shù)，但是術(shù)后患者的生活質(zhì)量仍然受到較嚴(yán)重影響，而且即使在技術(shù)成熟的醫(yī)學(xué)中心根治性膀胱切除術(shù)的術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率仍較高.由于根治性膀胱切除術(shù)對(duì)生活質(zhì)量的影響，患者可能傾向于選擇保留膀胱的手術(shù).因?yàn)榘螂撞糠智谐g(shù)患者相對(duì)根治性手術(shù)患者有較好的術(shù)后生活質(zhì)量，且并發(fā)癥相對(duì)較少，大部分病人樂(lè)于選擇保留膀胱.但是缺點(diǎn)是膀胱部分切除手術(shù)治療后，部分病人會(huì)發(fā)生切口腫瘤種植轉(zhuǎn)移等［1－4］.腫瘤種植的影響是多因素的，臨床上已有相應(yīng)原則用以預(yù)防切口腫瘤轉(zhuǎn)移，如無(wú)瘤操作，術(shù)野沖洗等.其中術(shù)前對(duì)病人實(shí)施膀胱內(nèi)抗腫瘤藥物保留灌注的方法也已經(jīng)應(yīng)用于臨床，并且通過(guò)大量臨床病例的觀察，發(fā)現(xiàn)膀胱癌開(kāi)放手術(shù)前給予患者行一定時(shí)間的抗腫瘤藥物膀胱保留灌注，可以明顯減少術(shù)后手術(shù)切口腫瘤種植轉(zhuǎn)移率［5－7］.但是臨床上對(duì)于手術(shù)切口腫瘤種植轉(zhuǎn)移率有多種影響因素，如無(wú)瘤操作原則遵守程度，手術(shù)方案的選擇等.僅從臨床數(shù)據(jù)觀察，不能說(shuō)明在單因素作用下術(shù)前藥物保留灌注的有效性.為排除相關(guān)因素影響(如無(wú)瘤操作原則遵守程度、手術(shù)方案的選擇等多因素影響)，說(shuō)明單因素(術(shù)前抗腫瘤藥物灌注)作用的有效性，探究術(shù)前藥物灌注減少手術(shù)切口腫瘤種植轉(zhuǎn)移率的可能作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建單一因素影響的大鼠切口腫瘤種植轉(zhuǎn)移模型，通過(guò)觀察種植后切口腫瘤轉(zhuǎn)移率及藥物處理后組織細(xì)胞凋亡率，證實(shí)在單因素(藥物處理膀胱癌組織)作用下可以有效降低其種植轉(zhuǎn)移率，探究藥物對(duì)腫瘤組織的殺傷作用為其潛在作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下.

1 材料和方法

1.1 材料

(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性SD大鼠100只，8～10周齡，體質(zhì)量220～300 g，購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則對(duì)大鼠給予人道的關(guān)懷.

(2)主要試劑 誘癌劑 N-甲基-N亞硝酸脲(MNU)，美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，貯存于－20℃;pH 6.0的磷酸鹽緩沖液(PBS);注射用鹽酸表柔比星注射液，輝瑞制藥有限公司生產(chǎn);無(wú)菌生理鹽水;Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒100tests，購(gòu)至泰勒生物技術(shù)有限公司.

(3)主要實(shí)驗(yàn)器材及儀器 Intima-II密閉式靜脈留置針(0.7 mm×19 mm，24 G);手術(shù)刀、手術(shù)剪刀、鑷子、持針器、縫線、各型號(hào)手術(shù)縫針，組織碾磨器，自制取組織針頭.BD LSRFORTESSA流式細(xì)胞儀器.

1.2 大鼠膀胱癌模型構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)分組

SD雌性大鼠40只用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(30 mg/kg)后，體積分?jǐn)?shù)為75%酒精消毒尿道外口.自制靜脈留置針導(dǎo)尿管插入大鼠膀胱，先用磷酸鹽緩沖液(PBS)5 mL灌洗大鼠膀胱兩次，然后將配置好的MNU溶液灌入大鼠膀胱0.5 mL，膀胱內(nèi)保留2 h.每次MNU 2 mg/只，兩周1次，共4次，MNU總量為8 mg.灌注后第10周造模形成荷瘤大鼠.

將30只荷瘤大鼠隨機(jī)平均分為A/B兩組.A組大鼠腹腔麻醉后插自制尿管并固定，PBS灌洗并抽凈膀胱內(nèi)液，膀胱內(nèi)灌注5 mL表柔比星溶液，濃度為10 mg/mL，使其在膀胱內(nèi)保留30 min.抽出表柔比星溶液，完整切除大鼠膀胱，打開(kāi)膀胱可見(jiàn)內(nèi)菜花樣增生腫物，小刀片小心刮取表面藥物浸潤(rùn)腫物，碾磨后備用.B組大鼠保留灌注液體為生理鹽水，其余處理同實(shí)驗(yàn)組，取腫物組織備用.

1.3 流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)

取等量每組處理后腫瘤組織以PBS漂洗，放在培養(yǎng)皿中.置200目不銹鋼篩上研磨過(guò)濾，用眼科剪反復(fù)剪碎組織，并不斷以PBS沖洗，吸取濾過(guò)的單細(xì)胞懸液置離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清，調(diào)整待測(cè)細(xì)胞濃度為1×105/mL，以細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，按試劑說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)凋亡率.本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.Cell Quest軟件獲取細(xì)胞，WinMDI軟件分析數(shù)據(jù).以FITC和PI熒光強(qiáng)度作雙參數(shù)點(diǎn)圖，在二維的FCM分析圖上，細(xì)胞分為四個(gè)亞群:左下象限，Annexin V－FITC－/PI－為活細(xì)胞群(V);右下象限，Annexin V－FITC+/PI－為凋亡細(xì)胞(AP);右上象限，Annexin V－FITC+/PI+細(xì)胞為繼發(fā)性壞死細(xì)胞(N);左上象限，Annexin V－FITC－/PI+為培養(yǎng)操作過(guò)程中出現(xiàn)的機(jī)械損傷細(xì)胞(O).最后，將所得數(shù)據(jù)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，觀察組間差異.

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

取60只健康大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組大鼠腹壁切口種植3針頭(1 mL鋼針裁剪剩余0.5 cm長(zhǎng)度插入碾磨后組織及取得定量組織)A組處理后膀胱癌組織，然后腹壁切口處逐層縫合.對(duì)照組大鼠種植3針頭B組處理后膀胱癌組織，然后腹壁切口處逐層縫合.兩組腹壁切口種植術(shù)后注意大鼠保暖以減少死亡率.大鼠清醒后繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)，每隔3 d觀察大鼠一般情況及腹壁切口種植處腫物生長(zhǎng)情況并記錄.所有手術(shù)器械使用前高壓消毒滅菌，處理完成后，大鼠腹部切口皮膚安爾碘消毒.

1.5 標(biāo)本采集

間斷觀察兩組大鼠一般情況及腹壁切口種植處腫物生長(zhǎng)大小情況，記錄腹壁切口出現(xiàn)腫物的大鼠例數(shù)及各組大鼠腹壁腫物大小，于種植第6周處死所有大鼠，腹壁切開(kāi)探查腫物，完整切除腫瘤，測(cè)量腫物大小，行病理切片檢查.

1.6 組織病理學(xué)檢查

采集的標(biāo)本統(tǒng)一石蠟包埋，制成組織切片，HE染色，顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化.

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)分組按照完全隨機(jī)分組，SPSS 13.0完成統(tǒng)計(jì)分析，大鼠切口成瘤數(shù)及細(xì)胞凋亡率數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本的大體觀察及病理結(jié)果

MNU誘導(dǎo)大鼠膀胱癌模型，造模過(guò)程中有3只大鼠由于麻醉不當(dāng)或尿路感染死亡，2只大鼠由于反復(fù)插尿管出現(xiàn)尿道結(jié)石，1只出現(xiàn)膀胱內(nèi)結(jié)石，均終止造模.其余大鼠 12周時(shí)，均有腫瘤形成(100%)且大多呈多發(fā)性，腫瘤大小不一，其他臟器和組織未見(jiàn)腫瘤;病理檢查證實(shí)均為大鼠膀胱尿路上皮癌(圖1;圖2).

圖1 SD大鼠正常膀胱粘膜組織(A HE×100、B HE×400)Fig.1 Normal bladder tissue of the SD rat(A HE ×100、B HE ×400)

圖2 MNU作用12周后的SD大鼠膀胱病理表現(xiàn)(A HE ×100、B HE×400)Fig.2 Histopathological characteristics of the SD rat bladder which was treated with MNU 12 weeks(A HE ×100、B HE ×400)

種植2周后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠腹壁出現(xiàn)可觸摸腫物的例數(shù)分別為1只(3.3%)和4只(13.3%)，3周后分別為 4只(13.3%)和 10只(33.3%)，4周后分別為 5只(16.6%)和 16只(53.3%)，觀察至第6周，未發(fā)現(xiàn)有大鼠再出現(xiàn)腹壁可觸摸腫物.種植后實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的大鼠切口腫物平均直徑大小，2周后分別為0.3 cm和0.45 cm，3周后分別為0.65 cm和1.25 cm，4周后分別為1.05 cm和1.87 cm，6周后分別為1.56 cm和2.45 cm(表1).6周后處死所有大鼠并解剖、病理檢查證實(shí)所有腹壁腫物為膀胱癌轉(zhuǎn)移瘤(圖3).

表1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠腹壁種植后不同時(shí)間段出現(xiàn)腹壁腫物的大鼠例數(shù)及每組切口腫物平均直徑大小Table 1 The mean diameter of incisional mass and the number of abdominal neoplasm in different period in experimental group and control group

圖3 實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織種植5周后SD大鼠切口腫物病理學(xué)表現(xiàn)(A HE×100、B HE×400)Fig.3 Histopathological characteristics of the SD rat incision neoplasm 5 weeks after tumor implantation in experimental group(A HE×100、B HE ×400)

2.2 凋亡率比較

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組腫瘤組織經(jīng)Annexin V/PI雙染后流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)(圖4).檢測(cè)結(jié)果顯示，凋亡率分別為:(36.67±1.63)%，(6.23±1.03)%.實(shí)驗(yàn)組大鼠膀胱腫瘤的AI大于對(duì)照組(P ＜0.05).

圖4 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組經(jīng)Annexin V/P I雙染色后流式細(xì)胞儀凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)比(A對(duì)照組，B實(shí)驗(yàn)組)Fig.4 The numbers of apoptoic cells in experimental group and control group by AV/PI(A control group，B experimental group)

3 討論

膀胱癌是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病，多數(shù)患者須行手術(shù)治療，而切口處腫瘤種植轉(zhuǎn)移是術(shù)后最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一.臨床上對(duì)于術(shù)后切口腫瘤種植轉(zhuǎn)移的預(yù)防已有相應(yīng)措施.我們通過(guò)大量臨床病例觀察發(fā)現(xiàn)，術(shù)前給予患者行一定時(shí)間的膀胱抗腫瘤藥物灌注，有降低術(shù)后切口腫瘤種植轉(zhuǎn)移率的可能.查閱文獻(xiàn)，也有報(bào)道指出通過(guò)臨床病例觀察發(fā)現(xiàn)術(shù)前灌注預(yù)防切口腫瘤種植轉(zhuǎn)移的有效性.目前相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道為臨床病例的觀察統(tǒng)計(jì)，未有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)予以證實(shí).由于臨床上術(shù)后切口腫瘤種植轉(zhuǎn)移是多因素影響，單從臨床病例觀察不能說(shuō)明術(shù)前灌注的絕對(duì)有效性.那么構(gòu)建動(dòng)物模型，在單因素影響下說(shuō)明其有效性則具有一定的意義.

本實(shí)驗(yàn)所涉術(shù)前處理為“化療藥物單次膀胱灌注”，即臨床上對(duì)膀胱癌患者術(shù)前行膀胱內(nèi)化療藥物保留灌注30 min.實(shí)驗(yàn)選用化療藥物為表柔比星，因?yàn)槠渲苄愿撸欣谠诎螂尊つぞ植堪l(fā)揮作用，而全身吸收很少，全身的副反應(yīng)較少，臨床上已廣泛應(yīng)用，預(yù)防和治療膀胱腫瘤療效肯定.同時(shí)有研究認(rèn)為膀胱灌洗化療能殺傷脫落的可能種植的癌細(xì)胞，基礎(chǔ)研究也表明化療藥物對(duì)體外培養(yǎng)的瘤細(xì)胞作用顯著［8－9］.腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)種植的原因主要基于腫瘤的生長(zhǎng)特性，因?yàn)榘螂啄[瘤多為移行細(xì)胞癌，而該種癌細(xì)胞易于種植成活生長(zhǎng)，且膀胱手術(shù)創(chuàng)面深，瘤細(xì)胞及細(xì)小癌組織如隨液體流入周?chē)鷦?chuàng)腔并停留于該處及皮膚切口部位，易發(fā)生種植轉(zhuǎn)移［9－11］.對(duì)于術(shù)前藥物灌注降低切口腫瘤種植轉(zhuǎn)移的原因，經(jīng)過(guò)分析可能為膀胱內(nèi)灌注化療藥物后，藥物能損傷或殺滅接觸的腫瘤細(xì)胞和組織，使膀胱癌患者在行手術(shù)治療時(shí)因手術(shù)操作引起的脫落至切口的腫瘤細(xì)胞或組織活性和種植能力降低［12－14］，達(dá)到減少切口腫瘤種植轉(zhuǎn)移率的目的.

為探究膀胱癌術(shù)前安全藥物灌注的作用及潛在機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)基于大鼠膀胱癌模型［15－18］構(gòu)建出大鼠腹壁切口腫瘤種植轉(zhuǎn)移模型，在單因素的作用下說(shuō)明了藥物保留灌注能夠降低切口種植轉(zhuǎn)移率，并通過(guò)觀察處理后腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)其潛在作用機(jī)制可能為抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞及組織的損害及殺滅，減少了有活力的腫瘤細(xì)胞及組織量.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)動(dòng)物模型驗(yàn)證，為膀胱癌術(shù)前藥物灌注的臨床應(yīng)用提供了一定的理論支持及參考.但對(duì)于術(shù)前藥物保留灌注減少切口種植轉(zhuǎn)率的作用機(jī)制仍需深入研究.

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