易艷萍， 楊成林， 彭雪梅， 盧春英， 鄒啟榮， 謝娟華， 李佳陽(yáng)

(1.暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，廣東廣州510630;2.深圳龍華新區(qū)人民醫(yī)院麻醉科，廣東深圳518109)

目前肺移植已成為治療終末期肺病的唯一有效的方法.UW(the University of Wisconsin solution，UWs)液是目前供器官灌注及冷保存的標(biāo)準(zhǔn)保存液，并已廣泛應(yīng)用于臨床.乳化氟碳(作為一種新的器官保存液，它以快速而又充分的向組織供氧，加快血流速度，增加器官供血量，改善微循環(huán)逐步受到關(guān)注［1－3］.本研究比較乳化氟碳和 UW液在不同時(shí)段對(duì)保存肺抗炎、抗氧化能力和組織結(jié)構(gòu)的影響，進(jìn)一步探討乳化氟碳保存液對(duì)供體肺的保存效果.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量350～400克，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.

(2)實(shí)驗(yàn)試劑 UW液(Bristol-Myers squibb，美國(guó))，乳化氟碳保存液(FCE)(北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司)，MDA(丙二醛，Malondialdehyde)和 SOD(超氧化物歧化酶，Superoxide Dismutase)檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)，MPO(髓過(guò)氧化物酶，Myeloperoxidase)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，IL-1β(白細(xì)胞介素-1β，Interleukin-1β)、IL-6(白細(xì)胞介素-6，Interleukin-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)檢測(cè)試劑盒(上海依科賽生物制品有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

(1)實(shí)驗(yàn)分組 將48只350～400克SD雄性大鼠隨機(jī)分為2組［FCE組(乳化氟碳保存液，Perfluorocarbon Emulsions)與UW組］，每組24只，其中FCE組又隨機(jī)分為FCE-6 h組與FCE-12 h組，UW液組隨機(jī)分為UW-6 h組與UW-12 h組，每組均為12只.FCE組均采用FCE保存液灌注與保存，分別置于溫度為0～4℃中保存6 h和12 h;UW組采用UW液灌注與保存，同樣分別置于溫度為0～4℃中保存6 h和12 h.在相應(yīng)的保存時(shí)間段后取肺組織檢測(cè)SOD及MPO活性及MDA、IL-1β、IL-6和TNF-α的含量，并取肺組織制成光鏡和電鏡切片觀察病理改變和超微結(jié)構(gòu)的變化.

(2)離體肺模型的建立與處理 參照Fischer's［4］所述方法建立離體肺模型，大鼠麻醉前30 min用硫酸阿托品0.4 mg/kg行肌肉注射，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%戊巴比妥鈉50 mg/kg行腹腔注射進(jìn)行麻醉，麻醉后行氣切置管，呼吸機(jī)維持通氣，設(shè)置潮氣量8 mL/kg，通氣頻率60次/min，正中開(kāi)胸，游離上、下腔靜脈，經(jīng)下腔靜脈500 U/kg肝素對(duì)大鼠進(jìn)行全身肝素化.將灌注管(22號(hào)靜脈穿刺針)自右心室插入肺總動(dòng)脈.結(jié)扎上下腔靜脈，用4℃ UW液(UW組)或乳化氟碳保存液(FCE組)對(duì)肺動(dòng)脈順行灌注，速率為4 mL/min，并剪開(kāi)左心耳減壓左心，灌注至雙肺組織成灰白色，灌注過(guò)程中肺持續(xù)通氣.灌注完畢后在肺中度膨脹時(shí)快速結(jié)扎氣管，切除整塊心肺置于4℃ UW液(UW組)或乳化氟碳保存液(FCE組)中分別保存6 h和12 h.

1.3 標(biāo)本的取樣與檢測(cè)

(1)光鏡標(biāo)本 在保存相應(yīng)的時(shí)間段后取出供肺，取各組相同部位肺組織于體積分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛溶液固定后，行HE染色后切片觀察肺組織病理學(xué)結(jié)果并行病理評(píng)分.由同一位實(shí)驗(yàn)者在光鏡下觀察以下項(xiàng)目:肺泡壁完整性、間質(zhì)充血、肺泡內(nèi)出血、間質(zhì)水腫、炎癥細(xì)胞;并進(jìn)行病理評(píng)分:無(wú)病理改變?cè)u(píng)為1分，病理變化輕微且位置局限為2分，病理變化顯著但位置局限或病理變化輕微但病變廣泛為3分，廣泛顯著病理改變?yōu)?分.

(2)電鏡標(biāo)本 取各組相同部位肺組織于戊二醛溶液固定后，制備電鏡超薄切片，觀察超微結(jié)構(gòu)的變化.

(3)炎癥及氧化指標(biāo)標(biāo)本 取各組相同部位肺組織用無(wú)菌冷磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后加入生理鹽水，再經(jīng)勻漿、離心后吸取上清液，采用ELISA法測(cè)定 MPO 活性和 IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量，TBA法測(cè)定MDA含量，WST法測(cè)定SOD活性，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理及分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用成組t檢驗(yàn)，病理評(píng)分進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗(yàn).P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 UW 組與 FCE 組供肺組織 IL-6、IL-1β、TNF-α的比較

兩組供肺組織 IL-6、IL-1β、TNF-α 在 6 h、12 h時(shí)間比較無(wú)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1.

表1 UW組與FCE組在不同時(shí)間點(diǎn)的IL-6，IL-1β，TNF-α含量的比較Table 1 Comparison of the levels of IL-6，IL-1β，TNF-α at different time point in the two groups± s，n=12)

表1 UW組與FCE組在不同時(shí)間點(diǎn)的IL-6，IL-1β，TNF-α含量的比較Table 1 Comparison of the levels of IL-6，IL-1β，TNF-α at different time point in the two groups± s，n=12)

1)各時(shí)間，兩組各指標(biāo)比較P＞0.05

?

2.2UW組與FCE組供肺組織SOD與MPO活性、MDA含量比較

UW組與FCE組的供肺組織的SOD活性、MDA含量比較無(wú)差異(P＞0.05);6 h組SOD活性低于相應(yīng)的12 h組，MDA含量和MPO活性高于相應(yīng)的12 h組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);UW組兩時(shí)間點(diǎn)的MPO活性低于FCE組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見(jiàn)表2.

2.3 病理積分

病理積分UW液組病理積分高于FCE組(P＜0.05);兩組6 h病理積分低于12 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表3.

表2 UW組與FCE組在不同時(shí)間點(diǎn)的SOD和MPO活性、MDA含量的比較Table 2 Comparison of the activity of SOD、MPO and the content of MDA at different time point in the two groups(±s，n=12)

表2 UW組與FCE組在不同時(shí)間點(diǎn)的SOD和MPO活性、MDA含量的比較Table 2 Comparison of the activity of SOD、MPO and the content of MDA at different time point in the two groups(±s，n=12)

1)P＞0.05 vs.UW group，2)P ＜0.05 vs.6 h group，3)P ＜0.05 vs.UW group.

?

表3 兩組兩時(shí)間點(diǎn)的供組織光鏡下病理積分比較Table 3 Comparison of the histopathological score at different time point in the two groups(±s，n=12)

表3 兩組兩時(shí)間點(diǎn)的供組織光鏡下病理積分比較Table 3 Comparison of the histopathological score at different time point in the two groups(±s，n=12)

1)P ＜0.05 vs.UW group，2)P ＜0.05 vs.6 h group.

?

2.4 供肺組織光鏡下病理變化

FCG-6 h組、FCE-12 h組肺組織結(jié)構(gòu)清晰較完整、無(wú)間質(zhì)充血和水腫，無(wú)肺泡內(nèi)出血，少量肺泡壁斷裂(黑色箭頭)，少量肺泡隔增厚(藍(lán)色箭頭)(見(jiàn)圖1 A、B)，少量肺泡隔增厚(藍(lán)色箭頭)少量炎癥細(xì)胞(紫色箭頭)(見(jiàn)圖1 E、F);UW-6 h組、UW-12 h組肺組織結(jié)構(gòu)清晰完整性較差，肺泡壁斷裂(黑色箭頭)、肺間質(zhì)及肺泡見(jiàn)少量紅細(xì)胞滲出(紅色箭頭)，肺泡上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞見(jiàn)空泡化(綠色箭頭)及大量炎癥細(xì)胞(紫色箭頭)(見(jiàn)圖1C、D、G、H).

2.5 供肺組織超微結(jié)構(gòu)變化

電鏡下UW-6 h組肺泡上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞邊界較清楚，線粒體輕度腫脹，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞板層小體模糊不清，F(xiàn)CE-6 h組肺泡上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，邊界清楚;線粒體嵴較完整，輕度腫脹(圖2A、C紅色箭頭)，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞板層小體清晰可見(jiàn).電鏡下UW-12 h組肺泡上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹明顯(圖2B紅色箭頭)，線粒體嵴結(jié)構(gòu)不清;基底膜可見(jiàn)中斷;Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞板層小體模糊，部分已經(jīng)空泡化(圖2B).FCE-12 h組肺泡上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞有輕度腫脹(圖2D紅色箭頭)，線粒體嵴較完整;基底膜連續(xù);Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞板層小體消失，空泡形成(圖2D).

圖1 兩時(shí)間點(diǎn)光鏡下兩組供肺組織病理變化Fig.1 The pathological changes of lung tissue of the two groups at different times under the light microscopy

圖2 兩時(shí)間點(diǎn)電鏡下兩組供肺組織超微結(jié)構(gòu)變化Fig.2 The ultrastructure changes of lung tissue of the two groups at different times under the electron microscopy

3 討論

乳化氟碳保存液因其顆粒小、攜氧高、氣體交換迅速，是良好人工氧載體，能快速充分向缺血組織供氧，抑制白細(xì)胞及血小板的聚集，改善微循環(huán)，有利于物質(zhì)交換和代謝［5－6］.乳化氟碳作用于離體腎臟、心臟和肝臟已有大量研究［2，7－8］，但在離體肺中的作用研究較少.本研究通過(guò)與常用器官移植保存液UW液對(duì)比，探索FCE在供肺組織中的作用.肺不同于肝、腎等實(shí)體器官，它是一個(gè)空腔臟器，安全的冷缺血保存時(shí)限短，保存時(shí)間僅 4～6 h［9］，易發(fā)生嚴(yán)重的缺血再灌注損傷，導(dǎo)致早期移植肺水腫和肺功能喪失.一般來(lái)說(shuō)肺發(fā)生缺血再灌注損傷的最直接原因是肺在保存過(guò)程中所經(jīng)歷的缺血缺氧［10］.良好的器官保存液對(duì)延長(zhǎng)肺的保存時(shí)間及提高供肺的質(zhì)量意義重大.

本研究發(fā)現(xiàn)兩組保存液在兩個(gè)時(shí)段的抗炎作用無(wú)明顯差異，兩組供肺組織IL-6、IL-1β、TNF-α的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因IL-6、IL-1β、TNF-α均為早期肺損傷促炎因子，能反映早期肺組織炎癥損傷程度.表明FCE保存液能下調(diào)炎癥因子的表達(dá)，減輕促炎反應(yīng)，與氟碳能在細(xì)胞表面形成一種密集但又具有擴(kuò)散性能的物理屏障有關(guān)［11］，它屏蔽了各種炎性介質(zhì)、炎性細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的接觸，起到了對(duì)肺的抗炎保護(hù)作用;UW液含有的腺苷具有抗炎作用［12－13］.也因供肺缺少血液有形成分，不易啟動(dòng)瀑布式炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)而產(chǎn)生大量炎性因子［14］.

MPO其水平及活性變化代表著多形核白細(xì)胞(PMN)的功能和活性狀態(tài)，反映中性粒細(xì)胞數(shù)量;MDA的含量反映脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，而SOD的高低則可以間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力.FCE與UW液均可減輕供肺保存期氧化損傷并較好的維持供肺抗氧化損傷的能力，F(xiàn)CE與其高效攜氧性有關(guān)，UW液則與其中所含有的谷胱甘肽能中和氧自由機(jī)有關(guān)［15］.本研究發(fā)現(xiàn):UW液兩個(gè)時(shí)段組MPO活性均高于FCE兩組，說(shuō)明FCE保存液可以更好的抑制中性粒細(xì)胞的活化與聚集，穩(wěn)定中性粒細(xì)胞，減少供肺的氧化損傷，F(xiàn)CE可通過(guò)減輕PMN的趨化反應(yīng)進(jìn)而減少PMN肺內(nèi)聚集［16］.本研究還發(fā)現(xiàn)隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組的SOD活性逐漸降低，MDA含量與MPO活性逐漸增高，可能因溶解在FCE中的氧逐漸耗盡，它造成了組織缺氧導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生，使得其穩(wěn)定中性粒細(xì)胞，抑制其活化與聚集的能力減弱，被激活的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生大量氧自由基，加重肺損傷［17］;UW液可能因高K+使肺組織血管收縮，血液中有形成分不易沖走，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，產(chǎn)生大量氧自由基［13］.此外，本研究供肺組織的病理積分FCE組優(yōu)于UW組，6 h組優(yōu)于12 h組，表明FCE能更好的抑制炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞的活化，從而降低內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞及基底膜屏障的通透性，減輕肺間質(zhì)和肺泡的水腫，達(dá)到肺保護(hù)的作用［18］.

綜上所述，乳化氟碳在供體肺中具有抗炎抗氧化能力，且乳化氟碳的抗氧化能力在兩個(gè)不同時(shí)段均強(qiáng)于UW液，對(duì)供肺的保存效果優(yōu)于UW液，而以保存6 h效果最佳.

［1］HOU S，DING H，LV Q，et al.Therapeutic effect of intravenous infusion of perfluorocarbon emulsion on LPS-Induced acute lung injury in Rats［J］.PLoS ONE，2014，9(1):e87826.

［2］彭雪梅，劉嘉弈，鄭志雄，等.乳化氟碳保存液對(duì)離體保存腎臟抗氧化能力及組織結(jié)構(gòu)的影響.［J］暨南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2013，34(6):599 －603.

［3］尹曉峰，錢(qián)國(guó)強(qiáng)，樊毫軍，等.全氟化碳乳劑預(yù)處理對(duì)急性肺損傷大鼠的保護(hù)作用［J］.中國(guó)急救醫(yī)學(xué).2014，34(1):53 －56

［4］FISCHER S，HOPKINSON D，LIU M Y，et al.Raffinose improves 24-hour lung preservation in low potassium dextran glucose solution:a histologic and ultrastructural analysis［J］.Ann Thorac Surg，2001，71(4):1140 －1145.

［5］HOSGOOD S A，NICHOLSON M L.The role of perfluorocarbon in organ preservation［J］.Transplantation，2010，89(10):1169－1175.

［6］CABRALES P，CARLOS BRICENO J.Delaying blood transfusion in experimental acute anemia with a perfluorocarbon emulsion［J］.Anesthesiology，2011，114(4):901－911.

［7］ISAKA M，SAKUMA I，SHIIYA N，et al.Experimental study of the relationship between perfluoro-octyl bromide emulsion and norepinephrine release in reperfusion arrhythmia:isolated guinea pig heart model［J］.Ann Thorac Cardiovasc Surg，2008，14(6):363－368.

［8］KINASIEWICZ A，SMIETANKA A，GAJKOWSKA B，et al.Impact of oxygenation of bioartificial liver using perfluorocarbon emulsion perftoran on metabolism of human heaptoma C3A cells［J］.Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol，2008，36(6):525 －534.

［9］HICKS M，HING A，GAO L，et al.Organ preservation［J］.Gen Thorac Cardiovase Surg，2009，57(12):635 －639.

［10］SLIVA C A，CARVAILHO R S，CAGIDO V R，et al.Influence of lung mechanical properties and alveolar architecture on the pathogenesis of ischemia-reperfusion injury［J］.Interact Cardiovasc Thorac Surg，2010，11(1):46－51.

［11］NAKATA S，YASUI K，NAKAMURAT，et al.Perfluorocarbon suppresses lipopolysaccharide and alpha-toxin-induced interleukin-8 release from alveolar epithelial cells［J］.Neonatology，2007，91(2):127 －133.

［12］MAZZON E，ESPOSITO E，IMPELLIZZERI D，et al.CGS21680，an agonist of the adenosine(A2A)receptor，reduces progression of murine type II collagen-induced arthritis［J］.Rheumatol，2011，38(10):2119 －2129.

［13］萬(wàn) 萍，陳 昊，白愛(ài)平.腺苷的免疫調(diào)節(jié)功能［J］.世界華人消化雜志，2014，22(17):2378 －2384.

［14］彭雪梅，席 露，王華東，等.乳化氟碳保存液對(duì)大鼠供肺的保護(hù)作用［J］.中華麻醉學(xué)雜志，2013，33(9):1082－1084.

［15］劉振威，高風(fēng)英.還原型谷胱甘肽對(duì)失血性休克型急性肺損傷相關(guān)炎性因子及抗氧化因子的調(diào)控及肺損傷的保護(hù)作用研究［J］.實(shí)用心腦肺血管病雜志，2013，21(4):30 －40.

［16］NAKAHARA H，LEE S，KRAFFT M P，et al.Fluorocarbon-hybrid pulmonary surfactants for replacement therapy—a Langmuir monolayer study.Langmuir，2010，26(23):18256－18265.

［17］ABRAM E.Neutrophils and acute lung injury［J］.Critical Care Medicine，2003，(4 Suppl):S195 － S199.

［18］XU-SHUFENG，WANG-PING，WEI-KUN，et al.Cytoprotection of perfluorocarbon on PMVECs in vitro［J］.Inflammation，2013，36(2):512 －520.