毛立梅戴建華張晏苗包蔚雷高園園朱春富張京平▲

1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院藥劑科，江蘇常州 213003；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院普通外科，江蘇常州 213003

小鼠膽囊膽固醇結(jié)石模型的建立

毛立梅1戴建華1張晏苗1包蔚雷2高園園2朱春富2張京平2▲

1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院藥劑科，江蘇常州 213003；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院普通外科，江蘇常州 213003

目的 建立簡單、可靠、高效的小鼠膽囊膽固醇結(jié)石模型，為研究膽石成因及防治提供重要手段。方法 C57BL/6小鼠隨機分為對照組和模型組，對照組喂飼基礎(chǔ)飼料，模型組喂飼致石飼料（基礎(chǔ)飼料加10%豬油、1%膽固醇及0.5%膽酸）。兩組小鼠分別于喂養(yǎng)4周和8周后，計算小鼠存活率，同時各取一半數(shù)量小鼠在乙醚吸入麻醉下手術(shù)取膽囊及血液標(biāo)本，分別檢測成石率、血脂濃度及膽汁膽固醇飽和度。 結(jié)果 對照組小鼠8周存活率100%，模型組小鼠死亡1只，存活率95%。對照組8周成石率為零，模型組4周成石率80%，8周成石率100%。血脂分析表明，與對照組比較，模型組4周和8周總膽固醇及低密度脂蛋白顯著升高（P＜0.01），甘油三酯濃度輕度升高（P＜0.05），高密度脂蛋白顯著降低（P＜0.01）。4周和8周時膽汁膽固醇飽和度測定，對照組分別為0.48±0.29和0.58±0.21，模型組分別為1.36±0.36和1.52±0.37，模型組膽固醇濃度處于過飽和狀態(tài)。 結(jié)論 本模型方法簡單、成石率高、動物死亡率低，可作為研究膽石成因及防治的備選模型。

膽固醇結(jié)石；膽囊；模型；小鼠

膽囊結(jié)石（主要為膽固醇結(jié)石）是常見病，且其發(fā)病率有增高趨勢［1］。目前膽囊結(jié)石的形成機制尚不清楚［2-3］。建立方法簡單、效果確切的膽囊結(jié)石動物模型可以為研究膽石成因及其防治提供極大便利。本文介紹一種簡單、高效的C57BL/6小鼠膽囊膽固醇結(jié)石模型的建立方法。

1　材料與方法

1.1 飼料及處理

基礎(chǔ)飼料按照美國營養(yǎng)學(xué)會嚙齒類AIN-93標(biāo)準(zhǔn)配方制定［4］。致石飼料為基礎(chǔ)飼料加10%豬油、1%膽固醇及0.5%膽酸。致石飼料在喂飼前放于蒸籠中蒸汽熏蒸20min，取出適當(dāng)冷卻后使用。

1.2 動物及分組

C57BL/6小鼠32只，8周齡，雌雄各半，清潔級，購自上海斯萊克實驗動物中心。購入后經(jīng)普通基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)2周后，隨機分為兩組，對照組12只，雌雄各半，每日以普通基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)；模型組20只，雌雄各半，每日以致石飼料喂養(yǎng)。兩組小鼠分別于喂養(yǎng)4周和8周后，各取一半數(shù)量小鼠在乙醚吸入麻醉下手術(shù)取材作相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.3 小鼠存活率測定

飼養(yǎng)過程中記錄各組小鼠存活情況，計算存活率。

1.4 膽囊膽固醇結(jié)石觀測

各組分別取膽囊，在顯微鏡下觀察膽固醇結(jié)晶形成情況；抽取膽囊膽汁，1000rpm離心后取沉渣在顯微鏡下觀察膽固醇結(jié)晶形成情況，采用紅外光譜溴化鉀壓片法鑒定結(jié)石性質(zhì)［5-6］。

1.5 血脂測定

經(jīng)心臟穿刺抽血，分離血漿后采用CX-7型全自動生化分析儀（美國Beckman）測定血漿總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoproteincholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（lowdensity lipoprotein-cholesterol，LDL-C）濃度。

1.6 膽囊膽汁膽固醇飽和度測定

抽取膽囊膽汁，離心去除膽固醇結(jié)晶，經(jīng)適當(dāng)稀釋后在全自動生化分析儀上測定膽汁總膽固醇、磷脂和總膽汁酸，通過Carey表［7］計算膽固醇飽和指數(shù)（cholesterol saturation index，CSI）。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1 小鼠存活情況

對照組小鼠在8周飼養(yǎng)過程中全部存活，存活率100%。模型組小鼠在飼養(yǎng)過程中死亡1只，存活率95%。

2.2 成石情況

對照組4周和8周膽囊內(nèi)膽汁澄清，皆未見結(jié)石結(jié)晶形成（圖1-A，圖2-A），成石率為零。模型組4周時即見膽囊內(nèi)膽汁渾濁，10只小鼠中有8只可見結(jié)石結(jié)晶形成，成石率為80%，8周時剩余9只全部檢測到結(jié)石，成石率為100%（圖1-B，圖2-B），紅外光譜溴化鉀壓片法鑒定為膽固醇結(jié)石。

圖2 顯微鏡下觀察膽汁標(biāo)本（×40）

2.3 各組血脂測定結(jié)果

兩組小鼠不同時間點血脂水平見表2。與對照組比較，模型組4周和8周TC濃度顯著升高（P＜0.01）；模型組8周與4周時比較無顯著差異（P＞0.05），說明模型組4周時血液總膽固醇濃度已處于較高水平，繼續(xù)致石飼料飼養(yǎng)并不能進一步顯著增高總膽固醇濃度。與對照組比較，模型組4周和8周TG濃度輕度升高（P＜0.05），升高幅度小于TC。與對照組比較，模型組4周和8周HDL-C顯著降低（P＜0.01），而LDL-C顯著升高（P＜0.01）。

表2 兩組小鼠不同時間點血脂水平（± s，mmol/L）

表2 兩組小鼠不同時間點血脂水平（± s，mmol/L）

組別　TC　TG　HDL-C　LDL-C 4周　8周　4周　8周　4周　8周　4周　8周對照組　2.08±0.29　2.15±0.45　0.51±0.16　0.54±0.18　1.56±0.29　1.54±0.33　1.09±0.16　1.12±0.16模型組　5.38±0.82　6.10±0.80　0.77±0.23　0.79±0.20　0.97±0.22　0.88±0.21　2.03±0.25　1.99±0.29 t -11.64　-11.05　-2.53　-2.54　4.66　4.89　-7.91　-7.64 P 0.00　0.00　0.02　0.03　0.00　0.00　0.00　0.00

2.4 CSI測定結(jié)果

對照組小鼠4周和8周時CSI分別為0.48±0.29和0.58±0.21，皆小于1，說明膽固醇處于未飽和狀態(tài)。模型組小鼠4周和8周時CSI分別為1.36±0.36和1.52±0.37，皆大于1，說明膽固醇濃度處于過飽和狀態(tài)。

3　討論

建立理想的膽囊膽固醇結(jié)石動物模型是研究膽石成因及其防治的重要手段。目前已有較多文獻報道建立膽囊膽固醇結(jié)石模型的方法［8-11］，但尚無統(tǒng)一、標(biāo)準(zhǔn)化的方法。理想的動物模型要求動物獲取方便、造模方法簡單、成石率高、可重復(fù)性好和動物死亡率低等。我們在借鑒文獻介紹方法的基礎(chǔ)上，成功建立了C57BL/6小鼠膽囊膽固醇結(jié)石動物模型。我們的結(jié)果表明，該造模方法具有簡單、實用、成石率高及動物存活率高等優(yōu)點。

對于造模動物的選擇，小鼠、豚鼠和兔等是常用的造模動物［8-10］。相對于其他動物而言，小鼠尤其是C57BL/6小鼠具有價格低廉、獲取方便，同時針對小鼠的各種抗體及檢測方法等亦更加豐富與齊全。因此我們選擇了C57BL/6小鼠作為造模對象。致石飼料是建立膽囊膽固醇結(jié)石模型的關(guān)鍵因素［8-12］。在我們的前期實驗中，我們綜合文獻介紹的方法，采用的飼料配方包括基礎(chǔ)飼料加膽固醇、蛋黃粉、蔗糖等成分及較高濃度的豬油（15%）和膽酸（1%），盡管獲得了較高的成石率（8周100%），但實驗小鼠不愿進食或進食量較少，存活率較低（約40%到70%）。分析其原因可能與致石飼料中成分較多、脂類與膽酸含量較高、成品飼料質(zhì)地偏硬、油脂味較重，導(dǎo)致小鼠咬食困難或不愿意進食等因素有關(guān)。在本研究中，我們?nèi)コ孙暳现蟹潜仨毘煞?，并降低了豬油與膽酸的濃度；同時，為降低飼料的硬度，我們在喂飼前將飼料在蒸汽中熏蒸，使其變松軟后再喂飼，小鼠進食量明顯增多。本研究結(jié)果表明，該配方簡單，成石率高，動物存活率較高，8周造模完成時存活率達(dá)95%。

高脂物質(zhì)的攝入及高血脂形成是人類膽固醇結(jié)石形成過程中的重要環(huán)節(jié)之一［13-14］。本模型中，小鼠在喂飼致石飼料后4周即出現(xiàn)了高血脂，其中主要為總膽固醇的顯著升高以及甘油三酯的輕度升高。同時，脂蛋白濃度亦出現(xiàn)了相應(yīng)的改變。在膽固醇結(jié)石形成機制中，目前認(rèn)為膽汁成分中膽固醇過飽和是形成膽固醇結(jié)石的重要條件［15-16］。在本模型中，我們檢測到實驗組小鼠膽固醇飽和指數(shù)大于1，即膽固醇過飽和的存在。因此，本模型通過攝入高脂物質(zhì)形成高血脂、膽汁膽固醇過飽和，最終導(dǎo)致膽固醇結(jié)石形成，有效地模擬了人膽固醇結(jié)石的形成過程，不失為研究膽固醇結(jié)石形成機制及防治的較好模型。

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Establishment of a C57BL/6 mouse model of cholesterol gallstone by lithogenic diet

MAO Limei1DAI Jianhua1ZHANG Yanmiao1BAO Weilei2GAO Yuanyuan2
ZHU Chunfu2ZHANG Jingping2
1.Department of Pharmacy，Changzhou No.2 People's Hospital，Affiliated to Nanjing Medical University，Changzhou 213003，China；2.Department of General Surgery，Changzhou No.2 People's Hospital， Affiliated to Nanjing Medical University，Changzhou 213003，China

Objective To establish a mouse model of cholesterol gallstone by lithogenic diet. Methods C57BL/6 mice were randomly divided into control group and experimental group. Mice of control group were fed with normal diet and those of experimental group were fed with lithogenic diet，which included 10% fat，1% cholesterol and 0.5% cholic acid. After 4- and 8-week's feeding， mice were sacrificed respectively and specimens were collected for further assay. Results The survival of mice was 100% in control group and 95% in experimental group in the end of 8-week's feeding.In control group，there was no gallbladder cholesterol stone formation.In experimental group，the rate of stone formation was 80% in week 4 and 100% in week 8， respectively. Blood lipid analysis indicated that the level of total cholesterol and low-density lipoprotein cholesterol were significantly higher in experimental group than those in control group in both week 4 and week 8 （P＜0.01）.On the other hand， the level of blood triglyceride in experimental group was slightly higher versus that in control group （P＜0.05） and high-density lipoprotein cholesterol remarkably lower versus that in control group （P＜ 0.01）. Bile analysis showed that super saturation of bile cholesterol in experiment group happened but no super saturation in control group. Conclusion It is a good method reported in this paper for the establishment of C57BL/6 mouse model of cholesterol gallstone by lithogenic diet.

Cholesterol gallstone；Gallbladder；Model；Mouse

R285.5

A

2095-0616（2014）06-30-04

2013-12-10）