高 萌李明仙李宇赤王婉麗李 光

1.西雙版納傣族自治州醫(yī)院中藥房，云南景洪 666100；2.西雙版納傣族自治州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南景洪 666100；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所，云南景洪 666100

柱前衍生化法測定麗江產(chǎn)瑪咖中18種氨基酸含量

高 萌1李明仙1李宇赤2王婉麗2李 光3▲

1.西雙版納傣族自治州醫(yī)院中藥房，云南景洪 666100；2.西雙版納傣族自治州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南景洪 666100；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所，云南景洪 666100

目的 測定麗江產(chǎn)瑪咖中必需氨基酸的含量。方法 以2，4-二硝基氟苯為衍生試劑，與麗江產(chǎn)瑪咖中18種氨基酸柱前衍生，用Waters 600高效液相色譜儀，菲羅門公司Symmetry C18色譜柱，以含1% N，N-二甲基甲酰胺的0.05mol/L醋酸鈉-醋酸緩沖液（pH=6.4）及乙腈∶水（1∶1）進行梯度洗脫，檢測波長為360nm，柱溫為35℃，進樣量為20μL。結(jié)果 18種氨基酸的線性回歸方程r值為0.9995～1.0000（n=5），平均回收率為99.54%～101.84%，RSD值為0.38%～1.82%，n=6。結(jié)論 本法快速、簡便，結(jié)果準(zhǔn)確。

柱前衍生化；瑪咖；氨基酸；2，4-二硝基氟苯；高效液相色譜法

Maca（lepidium meyenii walp.，一般音譯為“瑪咖”）是十字花科（cruciferae）獨行菜屬（lepidium）一年生或兩年生的草本植物，原產(chǎn)于秘魯海拔3500～4000m左右的胡寧（Junin）和帕斯克（Pasco）狹長地帶［1］?，斂г谀厦赖氖秤脷v史已經(jīng)有5800多年，傳統(tǒng)上作為食物和草藥，可改善性功能［2］，提高生育力，抗疲勞［3］，抗腫瘤和用于治療抑郁癥、哮喘癥和女性更年期綜合征等?，斂е泻胸S富的蛋白質(zhì)、氨基酸、?；撬帷⒌V物質(zhì)鋅［4］等與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的化學(xué)成分，而且傳統(tǒng)上瑪咖就具有顯著的增強精力的“適應(yīng)原樣作用”［5］。目前，以瑪咖為原料的保健食品、食品日益增多［6］，但鮮有相關(guān)質(zhì)量控制方法方面報道，氨基酸作為其保健主要成分，建立成熟的氨基酸測定方法，可為瑪咖鑒別、質(zhì)量控制、商品規(guī)格劃分提供參考。

大多數(shù)氨基酸無紫外吸收和熒光發(fā)射特征，為提高分析檢測靈敏度和分離選擇特性，通常將氨基酸進行衍生化。目前已經(jīng)報道的用于氨基酸柱前衍生的衍生試劑有多種［7-12］，不同的衍生劑都有各自的不足，而2，4-二硝基氟苯（DNFB）衍生化方法因其試劑價格低廉，操作簡便，所得產(chǎn)物相對穩(wěn)定等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用，本實驗參考文獻［13-14］采用該方法柱前衍生化測定麗江瑪咖中總氨基酸類成分，同樣考察水解因素及衍生化因素對結(jié)果的影響，有望為建立瑪咖藥材質(zhì)量控制方法提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 實驗材料

瑪咖購自麗江產(chǎn)地；醋酸（分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；2，4-二硝基氟苯（分析純，成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司）；醋酸鈉（分析純，成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司）；碳酸鈉（分析純，成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司）；乙腈（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；氫氧化鈉（分析純，成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司）；色譜純乙腈（美國 Fisher公司）；N，N-二甲基甲酰胺（分析純，成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司）；苯酚（分析純，成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司）；磷酸二氫鉀（分析純，成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司）；pH為7.0的磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L氫氧化鈉溶液29.1mL溶解0.68g磷酸二氫鉀，蒸餾水定容至100mL）；門冬氨酸等氨基酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為140624-200805）。

1.2 實驗儀器

Waters 高效液相色譜儀，Empower色譜工作站（美國沃特世公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；分析天平（賽多利斯公司）；電子天平（賽多利斯公司）；TGL16M湘智離心機（安徽誠信啟動設(shè)備有限公司）；酒精噴燈（上饒市教儀廠）。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Symmetry C18柱（5μm，4.6×250mm）。 流 動 相：A泵：含1%N，N-二甲基甲酰胺的0.05mol/L醋酸鈉-醋酸緩沖液（pH=6.4）。B泵：乙腈∶水（1∶1）。檢測波長：360nm；流速：1mL/min；柱溫：30℃。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別精密稱取氨基酸對照品適量，加入蒸餾水定容至50mL，精密量取1mL置安瓿瓶中，加入0.5mol/L碳酸鈉溶液混勻，再加入1% DNFB乙腈溶液1mL，震蕩，密封于50℃水浴避光反應(yīng)90min，反應(yīng)結(jié)束后，加入磷酸鹽緩沖液定容至10mL，作為對照品溶液。

1.3.3 樣品處理 精密稱取過3號篩樣品0.5000g置于安瓿瓶中，加入10mL含3%苯酚的6mol/L鹽酸溶液，密封后于105℃水解22h，反應(yīng)完成后后80℃水浴蒸干，加入少量蒸餾水超聲溶解后定容至10mL。取1mL定容后溶液，按“1.3.2項下”標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法進行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后放置至室溫，過0.45μm微孔濾膜，備用。

1.3.4 衍生化條件的優(yōu)化

1.3.4.1 衍生化試劑用量考察 取1.3.3項中定容后溶液1mL，分別加入衍生化試劑各1、2、3、4、5mL，與60℃衍生化60min，過濾后進樣。

1.3.4.2 衍生化時間考察 取1.3.3項中定容后溶液1mL，加入衍生化試劑各2mL，與60℃水浴中分別加熱30、60、90、120min，過濾后進樣。

1.3.4.3 衍生化溫度考察 取1.3.3項中定容后溶液1mL，加入衍生化試劑各2mL，分別在40、50、60、70、80℃水浴中加熱60min，過濾后進樣。

1.3.5 水解條件的優(yōu)化

1.3.5.1 鹽酸用量考察 精密稱取過3號篩樣品0.5000g置于安瓿瓶中，分別加入5、10、15mL含3%苯酚的6mol/L鹽酸溶液，按“1.3.3項下”方法處理最終定容至10mL。各取1mL溶液加入衍生化試劑2mL，與60℃避光反應(yīng)60min，濾液采用0.45μm微孔濾膜過濾，備用進樣。

1.3.5.2 水解時間考察 精密稱取過3號篩樣品0.5000g置于安瓿瓶中，按“1.3.3項下”方法處理水解改變?yōu)?0、22、24h，最終定容為10mL。各取1mL溶液加入衍生化試劑2mL，與60℃水浴中分別加熱反應(yīng)60min，0.45μm微孔濾膜過濾，備用進樣。

1.3.5.3 水解溫度考察 精密稱取過3號篩樣品0.5000g置安瓿瓶中，按“1.3.3項下”方法處理水解溫度改變?yōu)?05、100、110℃水解22h，最終定容為10mL。各取1mL溶液加入衍生化試劑2mL，與60℃水浴中分別加熱反應(yīng)60min，0.45μm微孔濾膜過濾，備用進樣。

1.3.5.4 苯酚用量考察 精密稱取過3號篩樣品0.5000g置于安瓿瓶中，加入10mL分別含苯酚0%、1%、3%、5%的6mol/L鹽酸溶液，按“1.3.3項下”方法處理最終定容為10mL。各取1mL溶液加入衍生化試劑2mL，與60℃水浴中分別加熱反應(yīng)60min，0.45μm微孔濾膜過濾，備用進樣。

2　結(jié)果

2.1 衍生化條件優(yōu)化

以所得色譜圖中除衍生化試劑峰外色譜峰峰面積為考察指標(biāo)，比較不同衍生化條件下對峰面積的影響，結(jié)果如圖1～3所示。

圖1 衍生化試劑用量對峰面積的影響

圖2 衍生化時間對峰面積的影響

圖3 衍生化溫度對峰面積的影響

2.2 水解條件優(yōu)化

以所得色譜圖中除衍生化試劑峰外色譜峰峰面積為考察指標(biāo)，將1.3.4項下樣品進樣，比較不同衍生化條件下對峰面積的影響，結(jié)果如圖4～7所示。

圖4 水解溫度對峰面積的影響

圖5 水解時間對峰面積的影響

圖6 鹽酸量對峰面積的影響

圖7 苯酚濃度對峰面積的影響

2.3 重復(fù)性試驗

精密量取水解后定容樣品溶液1mL，按供試品制備方法進行制備樣品，重復(fù)進行5次，分別測定樣品中各氨基酸峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。測得RSD范圍為0.908%～1.876%，RSD＜2%，說明試驗重現(xiàn)性結(jié)果良好。

2.4 精密度試驗

取“1.3.3項”下供試品制備的樣品，連續(xù)進樣6次，分別計算樣品中各氨基酸峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。測得RSD范圍為0.568%～1.962%，說明儀器精密度較好。

2.5 線性關(guān)系測定

稱取各氨基酸對照品適量，蒸餾水溶解后定容至100mL，分別精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL置安瓿瓶中，按“1.3.3項”下方法制備供試品溶液。設(shè)置進樣量為2μL注入液相色譜儀，選取濃度與峰面積為橫縱坐標(biāo)，計算線性方程，結(jié)果見表2。

實驗結(jié)果表明，各氨基酸對照品進樣濃度在上述范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.6 溶液穩(wěn)定性實驗

精密量取水解后定容樣品溶液1mL按“1.3.3項”下方法制備供試品溶液。于0、2、4、6、8h進樣，測定5次。除組氨酸RSD為4.825%外，其他氨基酸基本穩(wěn)定。建議樣品溶液制備完后，立即測定。如果保存一段時間測定，應(yīng)放到?jīng)霭堤帲朔椒ㄖ苽涔┰嚻啡芤嚎梢栽?h內(nèi)完成，對樣品穩(wěn)定性要求不高。

表2 氨基酸線性試驗結(jié)果

2.7 回收率實驗

精密稱取各氨基酸對照品適量與樣品混合，按“1.3.3項”下供試品制備方法進行樣品制備。進樣后分析各氨基酸回收率。結(jié)果表明各氨基酸含量平均值在99.62%～101.13%，RSD在1.03%～1.83%，說明各氨基酸的回收率符合要求。

2.8 樣品測定

精密稱取麗江瑪咖樣品0.50g，按照“1.3.3項下”樣品制備方法制備進樣，所得結(jié)果如圖8～9及表3所示。

圖8 18種氨基酸混合對照品色譜圖

圖9 麗江產(chǎn)瑪咖樣品色譜圖

表3 瑪咖樣品中氨基酸保留時間及含量

3　討論

瑪咖作為新資源食品已被廣泛認(rèn)知，保健食品市場逐漸擴大，微量元素及氨基酸可能是其主要的保健功效成分，本文采用DNFB柱前衍生化方法對測定中各氨基酸的含量進行測定，該方法具有反應(yīng)條件易于控制，操作簡便等優(yōu)點。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)對氨基酸含量影響較大的衍生化因素為溫度與時間，溫度過高氨基酸含量降低，可能是由于持續(xù)高溫會破壞氨基酸結(jié)構(gòu)造成氨基酸結(jié)構(gòu)相互轉(zhuǎn)化，實驗中發(fā)現(xiàn)盡管反應(yīng)條件不同，得到各氨基酸間比例變化，但總氨基酸量差異不大也從側(cè)面證實了該觀點，本實驗參考文獻報道［15］在酸水解液中加入苯酚是為了保護色氨酸基團不被破壞，最終確定加入3%含量的苯酚能夠達(dá)到很好的水解效果，并建議衍生化條件為溫度采用2倍量衍生化試劑，于50℃，反應(yīng)90min。

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Contents of 18 amino acids in MACA using pre-column derivatization method

GAO Meng1LI Mingxian1LI Yuchi2WANG Wanli2LI Guang3
1.Dispensary of Traditional Chinese Medicine，Dai Autonomous Prefecture of Xishuangbanna Hospital， Jinghong 666100，China； 2.Xishuangbanna Vocational and Technical Institute，Jinghong 666100，China； 3.Yunnan Branch， Institute of Medicinal Plant，Chinese Academy of Medical Sciences，Peking Union Medical College，Jinghong 666100，China

Objective To analyze the contents of 17 amino acids in MACA using pre-column derivatization method. Methods The amino acids in MACA were pretreated with 2，4-dinitro-fluorobenzene and their derivatives were analyzed on Waters 600 HPLC using Symmetry C18column. Gradienteluents consisted of sodium acetate solution（pH=6.4） with 1% N，N-dimethylformamide， acetonitrile and water（1∶1）. The Detection wavelength was 360nm and column temperature was 35℃. Results The calibration curves for 18 amino acidshad good linearity（r=0.9995～1，n=5）. The mean recoveries of 18 amino acids were 99.54%-101.84% with RSD 0.38%-1.82%（n=6）. Conclusion The method is quick， simple for the content analysis of the amino acids in the injections.

Pre-column derivatization；MACA；Amino acids；DNFB； HPLC

Q517

A

2095-0616（2014）06-33-05

2013-12-11）

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項（YZYN-11-03）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院青年科研基金項目（XHYN-01，3332013081）。