孫恒文，胡義德，曾子君，潘燚，方良毅，譚佩欣，曾向偉

(1.廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學科學院)腫瘤中心放療科，廣州 510080； 2.第三軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院全軍腫瘤中心，重慶 400037； 3.廣東醫(yī)學院附屬彭湃紀念醫(yī)院腫瘤科，廣東 海豐 516400)

1 引 言

基因芯片技術以其高通量、集約化的特點在分子生物學迅速發(fā)展的今天應用廣泛[1-3]。其實質為Southern技術的反向應用，既把探針固定在載體上，使基因樣本與探針在載體表面雜交。按功能可分為表達譜芯片[4]、測序芯片[5-6]、甲基化芯片[7]等。表達譜芯片是目前應用最廣泛的基因芯片，是將少則幾十個、多則成千上萬個特異的探針固定于一塊載體上，可用以檢測整個基因組范圍內的眾多基因在mRNA水平的變化。表達譜芯片可以分析2組或2組以上不同來源的mRNA轉錄豐度的差異，通過計算信號的比值和統(tǒng)計分析來獲取差異表達基因的信息。它不僅能為癌癥發(fā)生機制的研究提供強有力的工具，也能為癌癥的診斷治療提供新的依據。

目前表達譜芯片逐漸趨向于專業(yè)化，即專注于細胞功能的某一領域或某一種腫瘤相關基因[8-9]。線粒體是細胞能量代謝的中心，能量代謝的異常是腫瘤細胞的重要特征。因此，研究癌細胞mtDNA基因的整體表達變化具有重要生物學意義。本實驗研發(fā)的線粒體基因芯片將專注于mtDNA編碼基因及凋亡相關基因。本研究通過設計、優(yōu)化、合成寡核苷酸探針，點片成功后，對樣片進行熒光洗脫等處理，并采用兩個細胞系來源的cDNA文庫進行雜交，獲得了清晰的微陣列圖像，通過數據分析，能快速比較出兩個cDNA文庫中目標基因的表達差異。第一批點制此表達譜芯片20張，為進一步用于不同cDNA文庫及組織樣本中目標基因的差異表達研究奠定了物質及技術基礎。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1cDNA文庫 人宮頸癌上皮Hela細胞cDNA文庫和人腎小管上皮Hc1細胞cDNA文庫由北京博奧芯片公司提供。

2.1.2主要儀器 美國 Genomic Solution公司Genemachines 芯片點樣儀，Packard Bioscience公司Scanarry Express 雙通道激光掃描儀，Axon Instruments公司GenePix Pro 4.0 圖像分析軟件，Eppendor公司核酸真空濃縮儀。

2.1.3試劑與材料 QiAquick 核酸純化試劑盒購自Qiagen公司，Cy3、Cy5熒光染料、dNTP購自Amersham Pharmacia Biotech公司。Radom primer, 10×Klenow buffer, 5×first strand buffer, 0.1M DTT來自Invitrogen公司, Rnase Inhibitor來自Promege公司。氨基硅烷處理的玻璃基片，尺寸為75 mm×25 mm×1 mm。

2.2 方法

2.2.1芯片靶基因的選取及其特異寡核苷酸探針的設計 從Genebank及文獻中查得人mtDNA劍橋序列，以此為模板，設計mtDNA編碼的13種多肽、2種rRNA、9種tRNA及5種核調亡相關基因的探針序列，共包含目標基因29個(見表1)。

2.2.2寡核苷酸探針合成 設計的探針序列每個長約69 mer，共29個探針序列送交上海博亞生物技術有限公司合成，每個探針合成2OD。

2.2.3芯片的制備 用美國 Genomic Solution公司的Genemachines 芯片點樣儀按照預先設計矩陣，將探針混合液點至氨基硅烷修飾的玻璃基片上。樣點的直徑150 μm，間距25 μm。雜交區(qū)域包括陽性內參照、陰性內參照Negative、空白對照、外標擬南芥植物基因、芯片洗脫檢測點熒光素Hex和靶基因在內，每個探針作3個重復點，每個雜交區(qū)域包含132個樣點。

2.2.4細胞系cDNA文庫的熒光標記 所選細胞系為Hc1和Hela細胞系，實驗前將這兩個細胞系總RNA反轉錄成cDNA文庫。將反轉錄產物用核酸濃縮儀60℃濃縮至14 μl。各加入radom primer 4 μl用PCR儀95℃變性3 min，冰浴5 min。加入10×Klenow buffer 2.5 μl，dNTP 2.5 μl，Kelnow 1.2 μl，Hc1體系中加入Cy3 1 μl，Hela中加入Cy5 1 μl，分別進行熒光標記。

2.2.5芯片雜交前預處理 經過水合、膠連后，將芯片浸入0.5%SDS中，在脫色搖床上以50 rpm脫色8 min。再將芯片置入雙蒸水中，在脫色搖床上以50 rpm脫色8 min。最后放入無水乙醇中，在脫色搖床上以50 rpm脫色3 min。將清洗后的芯片放入玻片離心機中低速離心。芯片樣點中的Cy3熒光即被洗脫干凈。

2.2.6芯片的雜交 用3.6 μl滅菌去離子水、3 μl甲酰胺溶解熒光標記的cDNA，短暫離心。將溶解液轉移到另一管熒光標記的cDNA中溶解，將兩種用不同熒光素標記的cDNA混合，短暫離心。然后轉移到0.2 ml Ependorf管中，加入20×SSC 1.8 μl，1%SDS 2.4 μl, 50×Denhart’s 1.2 μl，混勻后離心。在PCR儀中95℃ 變性10 min，冰浴3 min。蓋玻片的小孔用微量吸頭緩慢注入12 μl的雜交液，雜交液會憑借液體表面張力在蓋玻片下面的凸面和芯片之間形成一道液膜?？焖侔巡Ｆ湃腚s交盒內，放入42℃水浴中，雜交5 h。cDNAHela標記Cy3紅色熒光，cDNAHc1標記Cy5綠色熒光，按某一基因的轉錄水平差異，掃描儀可檢測單個熒光的信號值，計算出兩種信號的比值也既兩種cDNA樣本同一基因mRNA轉錄水平。對兩熒光圖進行融合，既得到偽色圖。

2.2.7芯片雜交后的洗脫 雜交結束后，快速將蓋玻片在洗液Ⅰ中去掉，將芯片轉移到清洗盒中，放在水平搖床上緩慢清洗。清洗步驟如下：洗液I 2×SSC，0.2%SDS 42℃ 4 min,洗液II 0.2×SSC 42℃ 4 min。芯片清洗后，放在50 ml錐形離心管中低速離心，除去玻片表面殘存的液體，清洗并離心后的芯片立即進行掃描。

2.2.8芯片掃描與分析 用Scan Array Express雙通道激光掃描儀掃描芯片，掃描結果用GenPix Pro 4.0軟件進行分析。

3 結果

3.1 探針同源序列分析

用專業(yè)探針設計軟件，設計靶基因的寡核苷酸探針，探針長度69 mer，在Gnenbank中進行同源序列比對，與其它基因的同源性小于60%，得分137bit，Expect=2e-30，證明探針特異性強，達到芯片實驗要求[10]。

3.2 芯片的樣片掃描分析

點制完畢并過夜晾干的芯片放入芯片掃描儀內掃描。點樣液中除含有探針外，還含有Cy5，可發(fā)出綠色熒光，可直觀觀察點樣質量。掃描圖像可見芯片上樣點大小一致、規(guī)整度好，無漏點、連點，背景清晰，樣點矩陣符合預先設計。樣片外觀見圖1。圖2為樣片掃描圖。芯片上靶基因定位見表1。

圖1線粒體基因芯片外觀圖

Fig1AppearancefigureofmtDNAmicroarray

圖2芯片點制后樣片熒光掃描圖

Fig2Fluorescencescanningofsamplemicroarrayafterspotting

3.3 芯片雜交前的洗脫分析

芯片雜交前進行預處理及洗脫后，探針樣點區(qū)域的熒光徹底清洗干凈，整張芯片熒光本底均勻一致，不會影響后續(xù)雜交樣點的熒光信號。見圖3。

圖3芯片洗脫后掃描圖

Fig3Scanningfigureaftermicroarraywash-out

表1雜交位點熒光信號比值及靶基因定位信息

Table 1 Ratio of fluorescence signal after hybridization andtarget genes locations

注：1、2、3代表每個靶基因重復的3個位點，各靶基因在芯片上的位置由(行，列)坐標的方式表示，陰性對照、內標、外標基因的信號值未在表中顯示。

3.4 芯片雜交及信號分析

圖4為兩個細胞cDNA文庫與芯片雜交后掃描偽色圖。整張芯片雜交信號均勻，其中陰性對照Negative相應位點的熒光信號很弱，陽性對照人GAPDH、Actingβ基因相應位點信號較強且穩(wěn)定一致?？瞻讓φ諢晒庑盘栔岛托酒尘靶盘栔狄恢?。

表1中包含各雜交樣點上的熒光比值及對應靶基因在芯片上的定位。當比值大于2.0或小于0.5時認為該基因上調或下調。同一基因的熒光信號比值接近，數據具有一致性，芯片上的每個基因樣點在進行表達檢測時都是有效的。

圖4 芯片雜交掃描圖

3.5 熒光強度分布

根據靶基因的兩種熒光強度值作散點圖，見圖5。圖中縱坐標為掃描樣點Cy5熒光強度值，橫坐標為掃描樣點Cy3熒光強度值。圖4顯示了Hela和Hc1兩種細胞系mtDNA基因差異表達情況，結果可見有10個樣點信號比值在y=0.5x之下，有5個樣點信號比值在y=2x之上，癌細胞和正常細胞的mtDNA基因表達水平存在很大差異，雜交結果散點圖直觀反映了差異表達情況。

圖5 熒光強度分布圖

Table5Fluorescenceintensitydistributionfigure

4 討論

DNA芯片(DNA chip)技術是現代高新生物科技的杰出代表。表達譜芯片將成千上萬特異探針分子固定于載體表面，用于大規(guī)模平行檢測基因表達水平。基因芯片技術以其高通量、集約化、快速便捷的特點在眾多分子生物學技術中獨樹一幟。目前，其在抗腫瘤藥物的篩選、腫瘤的分子診斷和分子分型及腫瘤基因多態(tài)性等方面廣泛應用[11-14]。

本實驗成功制備了人mtDNA表達譜寡核苷酸芯片。從點樣后掃描圖可見芯片上樣點大小均勻一致，規(guī)整度好，樣點間無連點，無漏點，芯片點制理想。芯片雜交前洗脫徹底，洗脫后的芯片熒光本底均勻一致，確保雜交信號真實可信。雜交掃描圖顯示整張芯片雜交信號均勻，各基因的3個重復位點熒光信號均勻一致，各質控點按預期要求顯示，保證雜交結果的可靠性。散點圖真實反映了癌細胞和正常細胞線粒體表達基因的差異表達情況。芯片的制備、實驗方法和技術參數非常理想，可用于后續(xù)的實驗研究。

應用制備的寡核苷酸芯片檢測樣品基因的表達情況，其影響因素眾多。從實驗儀器的使用、芯片的制備、探針的設計合成到最后的雜交、結果分析判斷都可能對最終的結果產生影響，導致假陰性、假陽性，甚至出現檢測失敗[15]。下面對人mtDNA基因表達譜寡核苷酸芯片的制備及檢測，分析討論一些主要的影響因素。

4.1 芯片點樣儀

芯片點樣儀是芯片制備的主要儀器，其核心是集成的運動控制系統(tǒng)，包括x、y和z三個軸向的線性執(zhí)行機構。集成控制系統(tǒng)主要包括龍門式和懸臂式兩類。本實驗芯片制備所應用的為懸臂式集成控制系統(tǒng)。懸臂式系統(tǒng)可獲得±1 μm的運動精確度，較龍門式±10 μm高，保證了芯片點樣精確度和規(guī)整度[16]。并采用了微點樣鋼針接觸式點樣，每根鋼針都有一個平頭，這樣吸樣后鋼針的頭部就會形成一個薄膜。因此，點樣直徑在很大程度上由鋼針尖部的尺寸決定，從芯片點制后掃描圖(圖2)上可見樣點直徑均一，這為后續(xù)準確檢測每個樣點的信號提供了重要保證。接觸式點樣并不能保證探針溶液在樣點范圍內的均勻分布，但這并不影響芯片數據的數模轉換及后續(xù)的統(tǒng)計分析。

4.2 芯片掃描儀

芯片掃描儀將雜交的結果保存為圖像信息，并通過特殊軟件將圖像信息轉化為數字信息，即微陣列芯片的檢測過程。掃描儀的相關參數決定了芯片檢測的質量和效率，如通量、精度、重復性、分辨率、靈敏度和動態(tài)范圍等。其中與本芯片最相關的一個重要指標是通道數，通道數決定了芯片能夠檢測不同標記物的數量。本實驗使用的掃描儀為激光雙通道掃描儀，可一次性得到兩個熒光圖像。與單通道掃描相比具有快速、圖像重疊簡單和無機械位移造成的偏差等優(yōu)點。要得到高質量的圖像和穩(wěn)定的數據，芯片掃描有以下幾點體會：(1)由于芯片掃描儀具有極高的靈敏度和分辨率，應注意芯片實驗操作的潔凈；(2)芯片完成雜交和清洗后，盡可能立即掃描，防止熒光分子的光漂白；(3)掃描儀中有機械傳動裝置，儀器應放置在平穩(wěn)堅固的平臺上，并防止外源性震動。

4.3 探針設計

寡核苷酸芯片要求靶基因的序列是已知的。設計探針時所用的模板序列必須是被國際認同的標準序列。本實驗采用人mtDNA的劍橋序列為模板序列，該序列是國際公認的人mtDNA標準序列。

寡核苷酸探針的長度也會影響芯片實驗，探針包含的堿基數越多探針雜交特異性越強，芯片結果的假陽性也就會越少。另外，較長的寡核苷酸探針不易受到局部極端序列組成的影響，因為GC和AT富含區(qū)通常只延續(xù)很短的長度。本實驗采用69 mer探針的長度范圍可以對這種極端序列造成的影響有很好的平均效應。但有時無法從本身長度較短的基因序列中選出符合要求的探針。本實驗原計劃將mtDNA編碼的2種rRNA、22種tRNA、13種mRNA共47種基因全部選為靶基因。但22種tRNA基因中有些基因自身長度只有70～80bp，無法選出符合條件的探針，只能將其從靶基因中剔除。經過篩選，本芯片的靶基因中包括了22種tRNA基因中的9種。

4.4 芯片數據處理及結果的分析判斷

歸一化是芯片數據采集中必需的，是數據采集后的第一步，是對不同通道和不同芯片來源的數據進行分析之前，消除各系統(tǒng)誤差的過程。對不同數據集進行數據處理的數值稱為歸一化因子。進行歸一化處理不會改變數據的內容，而是糾正其中次要的不平衡，這些因素來自下列各種差異對成像過程的影響，包括標記和雜交效率及洗脫的差異、不同染料的量子產量差異、激光功率和監(jiān)測儀靈敏度的變化，以及許多其它原因造成不同芯片和不同通道間的微小差異。歸一化保證了比值計算和其它數值比較結果的精確性，未經歸一化處理的圖像可能無法正確顯示這些比較結果。

4.5 假陽性、假陰性原因分析

基因芯片的巨大優(yōu)勢在于其高通量。由于生物學反應過程中，例如酶學反應、RNA抽提等過程有一些不能完全人為控制的因素存在，因此，實驗結果有時會產生假陽性、假陰性。要得到一個重要的生物學結論，往往需要重復實驗。對于一對樣品，若要真實了解其中差異表達的基因，至少做兩張芯片，進行熒光交換。而對一種現象，如藥物對細胞的影響，還要進行生物材料上的重復實驗。對于研究腫瘤樣品中與正常人的差異表達基因，可以選擇多個腫瘤樣品，每個樣品與正常樣品比較，同時在一張芯片上雜交，而后尋找在多個腫瘤樣品中共同變化的基因。另外，對芯片實驗中的陽性或陰性基因用Northen或real-time PCR的方法進行驗證實驗可直接檢驗芯片實驗的結果，也是排除假陽性、假陰性的最有力的方法[17]。

本實驗制備的芯片在初步應用時雖未采取對同一樣本的重復雜交實驗，但是在芯片上對同一靶基因探針進行了3次重復點樣，并采用了熒光交換。這樣對同一個靶基因可得到6個熒光信號比值，并用t檢驗作出統(tǒng)計學結論，從而最大程度的降低假陽性或假陰性的發(fā)生，保證了實驗結果的真實可靠。最后用real-time PCR對陽性表達基因進行驗證，實驗結果一致，說明芯片制備過程及實驗方法科學、合理，得出的結論可反映基因表達的真實變化。

本實驗成功制備了人mtDNA基因表達譜芯片，完善了該芯片的制備和使用程序，通過初步應用，證明所研制的人mtDNA基因表達譜芯片具有特異性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，可用于不同組織或細胞樣本cDNA文庫mtDNA基因差異表達分析。