解生權+全艷玲

摘要：以紫外線誘變后得到的多脂鱗傘（Pholiotasdiposa）的菌種作為出發(fā)菌種，對其進行化學誘變劑處理。結果表明，采用亞硝酸鈉終濃度3450mg/L誘變10min、亞硝酸鈉終濃度6900mg/L誘變5min所得到的變異菌株菌絲生長速度、菌絲產量和栽培的生物轉化率都有所提高。

關鍵詞：多脂鱗傘；化學誘變；育種；亞硝酸鈉；生長速度；產量；生物轉化率

中圖分類號：S646.036 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0244-02

各種研究表明，多脂鱗傘（Pholiotasdiposa）作為食用真菌具有極其豐富的營養(yǎng)價值，含有大量的人體必需氨基酸、礦物質、維生素等，是理想的營養(yǎng)食品之一；此外，其體內還有多糖、麥角固醇、核酸等生物活性物質，對提高機體免疫力、抑菌、抗癌、延緩肌肉疲勞、恢復精力和腦力十分有效。各地栽培經驗證明，多脂鱗傘具有適應性強、原料易得、質優(yōu)高產、商品性狀好、抗污染能力強等優(yōu)點，是一種具有開發(fā)價值、市場前景好的食用菌，其推廣栽培已經引起人們的重視；但是，各地栽培所使用的菌種大都是野生馴化而來的，產量都不盡如人意。本研究將栽培使用的菌種經過紫外線誘變得到1株高產的菌株（UV-65），并在此基礎上對其菌絲體進行化學誘變，以期得到產量更高的菌株。

1.材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種來源經過紫外線誘變得到的菌株UV-65。

1.1.2培養(yǎng)基及制備（1）液體培養(yǎng)基。馬鈴薯（去皮）100g、胡蘿卜100g、葡萄糖20g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂1g、蛋白胨10g，水1000mL。馬鈴薯與胡蘿卜分別煮汁、過濾后合并，再加入其他成分，補足水分后充分溶解再分裝到500mL錐形瓶中，每瓶200mL，121℃滅菌30min，備用。（2）固體培養(yǎng)基。馬鈴薯（去皮）100g、胡蘿卜100g、葡萄糖20g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂1g、蛋白胨10g、瓊脂20g，水1000mL。按上述方法溶解滅菌，做成斜面、平板備用。（3）栽培培養(yǎng)基。闊葉木屑78%、玉米粉20%、蔗糖1%、石膏1%，水60%，pH值自然。常規(guī)拌料、裝袋、126℃滅菌2h。

1.2方法

1.2.1活化菌種將液體石蠟保藏的UV-65出發(fā)菌種接種到斜面培養(yǎng)基上，（26±2）℃下避光培養(yǎng)。待菌絲長滿試管后，再傳代1次，長滿后作為母種使用。

1.2.2液體菌種的制備用無菌接種鏟取一小塊活化的母種（0.5cm×0.5cm），盡量去除培養(yǎng)基，接種到液體培養(yǎng)基中，并使其漂浮在液面上。然后置于（26±2）℃、160r/min左右的全溫振蕩培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，待瓶中菌絲球生長到2～3mm、發(fā)酵液澄清透明且無污染時停止培養(yǎng)，置于4℃下保藏備用。

1.2.3誘變處理利用不同濃度的亞硝酸鈉對液體培養(yǎng)出的菌絲球進行不同時間的誘變處理，即取5mL上述菌懸液加入100mL無菌的錐形瓶中，并用無菌水稀釋至10mL，再加入無菌亞硝酸鈉溶液，使之最終濃度為0、3.45、6.9、10.35、13.8、17.25g/L，每個濃度3個平行樣本，以終濃度O為空白對照。對以上各個等級的樣本在（26±2）℃、160r/min的條件下分別振蕩5、10、15、20、25、30min，再加入pH值為8.6的Na2HP04溶液，調整pH值為7，終止誘變作用。

1.2.4菌種篩選將上述進行不同誘變處理時間的各個濃度等級中的懸液混勻，無菌取等量的懸液接種到平板培養(yǎng)基上，（26±2）qC下避光培養(yǎng)，計數不同誘變處理時間、不同濃度的菌落數量，并計算致死率。對致死率達到75%-90%的組別中的培養(yǎng)菌落進行生長速度的測定。

2.結果與分析

2.1不同方式誘變處理后的菌落培養(yǎng)情況

用不同濃度的亞硝酸鈉對上述液體培養(yǎng)物進行不同時間的誘變，培養(yǎng)出的菌落情況見圖1。

2.2目的菌株的篩選

從圖1可以看出，當在亞硝酸鈉終濃度為3.45g/L下誘變10nlln、在亞硝酸鈉終濃度為6.90g/L下誘變5min時，致死率在75%～90%之間。對其進行編號（UVN6500510-1、UVN6500510-2、UVN6500510-3、UVN6500510-4、UVN6500510-5、UVN6500510-6；UVN65015-1、UVN65015-2、UVN65015-3、UVN65015-4）并測定其生長速度和生長量。

2.2.1

固體培養(yǎng)時菌絲生長速度的測定將上述所有篩選出的菌株分別轉接到平板培養(yǎng)基上，按前述的方式進行培養(yǎng)后，用無菌打孔器（直徑0.5cm）切取種塊（盡量去除培養(yǎng)基）接種到12cm平板培養(yǎng)基上，每隔48h測量菌落直徑（表1）。

2.2.2液體培養(yǎng)時菌絲生長量的測定取所有篩選出的菌株接入液體培養(yǎng)基，在（26±2）℃、160r/min下振蕩培養(yǎng)，每隔24h混勻并定量取樣，相同離心力下離心相同時間并烘干至恒質量，再稱其質量，結果見表2。

從表1、表2可以看出，菌株UVN6500510-4、UVN6500510-5、UVN65015-3的生長速度和菌絲產量都比出發(fā)菌株提高了10%以上；而其他菌株雖然也有所提高，但是幅度較小，有些不具有統(tǒng)計學意義。

2.2.3栽培生物轉化率的比較取上述3種變異菌株的斜面種接種到栽培培養(yǎng)基中，并以出發(fā)種作為對照，霉菌培養(yǎng)箱[溫度（26±2）℃、濕度65%]中避光培養(yǎng)，觀察菌絲生長速度時發(fā)現，長滿栽培培養(yǎng)基的時間分別為24.67、25.15、24.86、29.13d。由此可見，變異菌株栽培時菌絲生長速度也有所加快。菌絲長滿后，進行必要的溫差、濕差的刺激出菇，連續(xù)采摘3次，計算生物轉化率（表3）。

2.2.4變異菌株的遺傳穩(wěn)定性將菌株UVN6500510-4、UVN6500510-5、UVN65015-3做成斜面種保存在液體石蠟中，在此期間連續(xù)5次傳代，并測定每代菌絲生長速度、發(fā)酵產量。結果發(fā)現，經過長期保存并多次傳代菌絲生長速度、發(fā)酵產量、生物轉化率3項指標未發(fā)生統(tǒng)計學意義上的變化，說明這3株菌株遺傳性狀是比較穩(wěn)定的，可以應用于規(guī)模栽培。

3.結論

微生物育種運用遺傳學原理和技術對某種具有特定生產目的的菌株進行改造，以提高產品的產量和質量。微生物菌種選育技術在現代生物技術中，特別是發(fā)酵產業(yè)中具有十分重要的地位。通過對微生物菌種的選育可以有效提高產品的產量和質量。微生物育種技術主要有自然選育、誘變育種、雜交育種、代謝控制育種和基因工程育種等5種方式，各種方式并不孤立存在，而是相互交叉、相互聯系的。新的育種技術的發(fā)展和應用促進了生產的發(fā)展，而現在最常用的育種方式是誘變育種，即利用物理、化學誘變劑對微生物進行處理，從而篩選出主要生物性狀優(yōu)良的變異菌株。本研究對紫外線誘變得到的變異菌株利用典型的化學致變劑進行進一步的化學誘變，實際上進行復合誘變，篩選出3株菌抹，其生長速度、發(fā)酵產量、生物轉化率等主要生物學指標較原始菌株都有較大的提高，這對大規(guī)模種植增產奠定了堅實的基礎。變異菌株進行發(fā)酵、栽培所得產物的成分變化有待進一步研究。endprint