趙鑫，肖玉平，李立英

（1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，廣東廣州510300；2.廣東高校特色調(diào)味品工程技術(shù)開發(fā)中心，廣東廣州510300）

黃色短桿菌產(chǎn)L-精氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

趙鑫1，2，肖玉平1，李立英1

（1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，廣東廣州510300；2.廣東高校特色調(diào)味品工程技術(shù)開發(fā)中心，廣東廣州510300）

在液體培養(yǎng)條件下，采用單因素試驗法，考察了發(fā)酵培養(yǎng)基中不同濃度的碳源、氮源、無機鹽和生物素對實驗室篩選獲得的黃色短桿菌L-Arg高產(chǎn)突變株GC 1325產(chǎn)酸的影響，確定了碳源和氮源的初始濃度和補加方式。實驗結(jié)果表明，GC 1325發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)基為：葡萄糖100 g/L，（NH4）2SO425 g/L、KH2PO41.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.6 g/L、生物素100 μg/L；發(fā)酵過程中24 h后一次流加50 g/L葡萄糖維持碳源；連續(xù)流加25%的氨水維持（NH4）2SO4濃度在25 g/L水平，在此優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，GC 1325獲得的最大的L-Arg產(chǎn)量為37.8 g/L，比優(yōu)化前提高了58.8%。

黃色短桿菌；發(fā)酵培養(yǎng)基；優(yōu)化；L-精氨酸

L-精氨酸（L-Arginine，簡寫L-Arg）是氨基酸中的重要品種之一，是合成蛋白質(zhì)和肌酸的重要原料，在醫(yī)藥、營養(yǎng)保健、食品工業(yè)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛［1］。隨著人們生活水平的提高，Arg的需求量逐年遞增，而國內(nèi)L-Arg的生產(chǎn)技術(shù)落后，依賴從日本等國家進口［2］。LArg工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵是發(fā)酵，發(fā)酵水平的高低決定產(chǎn)品成本。提高發(fā)酵水平的途徑有二條：一是選育適合工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)良菌種；二是獲得與生產(chǎn)菌種相匹配的最佳發(fā)酵條件［3］。培養(yǎng)條件的優(yōu)化與否直接影響到代謝方式及代謝流量的變化［4］，從而影響到目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。發(fā)酵條件優(yōu)化的研究也是實現(xiàn)菌株從實驗室研究階段，邁向工業(yè)生產(chǎn)階段的一個必經(jīng)之路。本文采用單因素試驗法，優(yōu)化了本實驗室篩選獲得的LArg高產(chǎn)突變菌株GC1325的發(fā)酵培養(yǎng)基，在一定程度上提高了菌株的產(chǎn)酸量。

1材料與方法

1.1菌種

本實驗室篩選獲得的L-Arg高產(chǎn)突變株GC 1325（Brevibacterium flavum，His-，Suc-，D-Argr，SMCr）。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g/L）

葡萄糖10，（NH4）2SO43，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，MnSO4·H2O 0.02，瓊脂20，生物素3×10-5，硫胺素2×10-4，L-組氨酸5×10-4。pH 7.0～7.2，121℃滅菌20 min。

1.2.2種子培養(yǎng)基（g/L）

葡萄糖30，玉米漿20，（NH4）2SO420，KH2PO41，MgSO4·7H2O0.5，尿素1.5。pH7.0～7.2，121℃滅菌20min，裝液量30 mL/250 mL。

1.2.3發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）

葡萄糖，玉米漿25，（NH4）2SO4，KH2PO41.2，MgSO4·7H2O 0.6，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，生物素1×10-4，L-組氨酸5×10-4，CaCO330。pH7.0～7.2，121℃滅菌15 min。（葡萄糖和硫酸銨濃度根據(jù)實驗需要調(diào)整）。

1.3主要試劑

酵母膏、組氨酸、生物素等為國產(chǎn)生化試劑；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4主要儀器

往復(fù)式搖床搖床：無錫查橋輕機廠；5 L自動控制發(fā)酵罐：上海保興生物設(shè)備工程有限公司（Biotech-2001）；722分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.5主要實驗方法

1.5.1發(fā)酵條件

搖瓶發(fā)酵為250 mL三角瓶裝液30 mL，發(fā)酵結(jié)束后補水至原體積。5 L發(fā)酵罐中裝液量2.5 L，接種量6%～8%，流加25%的氨水控制pH在7.0。通風(fēng)量4 L/min，攪拌轉(zhuǎn)速為600 r/min。

1.5.2氨離子的濃度測定

納氏試劑法。

1.5.3培養(yǎng)液光密度值的測定

取培養(yǎng)好的培養(yǎng)液用0.25 mol/L的HCl適當(dāng)稀釋后，以0.25 mol/L的HCl為空白對照，用721分光光度計測定OD值。

1.5.4發(fā)酵液中還原糖的測定

3，5-二硝基水楊酸法。

1.5.5L-Arg的定量測定

改良坂口試劑法［5］。

2結(jié)果與討論

2.1碳源對L-Arg發(fā)酵過程的影響

2.1.1不同碳源對L-Arg產(chǎn)量的影響

碳源是構(gòu)成菌體和合成氨基酸的碳架及能量的來源。不同微生物所具有的酶系不同，所能利用的碳源也不同。目前發(fā)現(xiàn)精氨酸產(chǎn)生菌均不能利用淀粉，分別在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加100 g/L的不同常用碳源，產(chǎn)酸量的結(jié)果見表1所示。

表1　不同碳源對精氨酸產(chǎn)量的影響Table 1Effects of different carbon sources on the yield of L-Arginine

由表可知，以葡萄糖、蔗糖作為唯一碳源時，該菌株的L-Arg產(chǎn)量較高?？紤]到原料來源，確定以葡萄糖為碳源。

2.1.2不同初糖濃度對GC1325產(chǎn)酸及糖利用的影響

采用搖瓶分批發(fā)酵，考察了初糖濃度分別為60、100、140和180 g/L的條件下的發(fā)酵過程，結(jié)果如圖1所示。

圖1　不同的初始葡萄糖濃度對OD值和L-Arg產(chǎn)量的影響Fig.1Effects of different initial glucose concentrations on OD value and the yield of L-Arginine

從整個發(fā)酵過程來看，60 g/L的初始葡萄糖對GC1325菌體生長最為有利，該條件下菌體生長最早達到平衡期，100 g/L的葡萄糖次之，140、180 g/L的葡萄糖則對菌體生長有一定的抑制作用，菌體生長達到平衡期的時間較低糖濃度時明顯延長。此外，60、100 g/L的初糖濃度時，發(fā)酵終了的殘?zhí)禽^低，分別為0和4.7 g/L；而140、180 g/L的初糖濃度下的發(fā)酵終了葡萄糖殘?zhí)禽^高，分別為44.2和83.6 g/L，不利于糖酸轉(zhuǎn)化率的提高以及產(chǎn)品的后續(xù)生產(chǎn)。初始葡萄糖濃度為60、100 g/L時發(fā)酵前期（0～48 h）精氨酸的合成速率較快，但葡萄糖消耗速率也較高糖濃度時快，造成后期（48 h）發(fā)酵液中殘留葡萄糖濃度偏低（0～50 g/L），此時精氨酸合成速率降低，因而最終精氨酸的積累量偏低。

比較不同初糖濃度下精氨酸的生產(chǎn)強度和糖酸轉(zhuǎn)化率（表2所示）可以發(fā)現(xiàn)，初始葡萄糖濃度為100、140 g/L時，兩者的生產(chǎn)強度相近，但100 g/L的初始葡萄糖濃度下的糖酸轉(zhuǎn)化率高于初糖濃度為140 g/L時的糖酸轉(zhuǎn)化率。

表2　不同初糖濃度下糖酸轉(zhuǎn)化率和L-精氨酸的生產(chǎn)強度Table 2Effects of different initial glucose concentrations on glucose acid invert ratio and the L-Arg productivity

2.1.3葡萄糖補加時間的確定

100 g/L的初始葡萄糖濃度下存在發(fā)酵后期葡萄糖濃度偏低，產(chǎn)酸能力下降的問題，考慮在發(fā)酵過程中補加葡萄糖補充碳源。分別在不同時間一次補加50 g/L葡萄糖，考察了不同的補加時間對發(fā)酵96 h后產(chǎn)酸量和最終殘?zhí)菨舛?，結(jié)果如圖2所示。

圖2　不同的補加葡萄糖時間對L-Arg產(chǎn)量和殘?zhí)菨舛菷ig.2Effects of different glucose fed time on the yield of LArginine and the residual sugar concentration

由圖2并結(jié)合前面的結(jié)果可以看出，初糖濃度過高會明顯抑制菌體生長，而補糖則可以明顯改善后期糖濃度不足引起的產(chǎn)酸下降狀況；從精氨酸合成的角度來看，發(fā)酵至24 h時補加葡萄糖的效果最好，且該條件下發(fā)酵終了時殘?zhí)菨舛茸畹汀?/p>

2.2氮源對L-Arg發(fā)酵過程的影響

2.2.1不同氮源對于GC1325發(fā)酵的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中必須含有較高比例的氮源才可以滿足菌體生長和合成L-Arg的需要。不同氮源菌株的產(chǎn)酸量見表3所示。

表3　不同氮源對精氨酸產(chǎn)量的影響Table 3Effects of different nitrogen sources on the yield of L-Arginine

由表可知，以硫酸銨作氮源時，可獲得最大的產(chǎn)酸量。硫酸銨是培養(yǎng)基內(nèi)的無機“速效氮源”，它更容易被早期增殖生長的菌體所利用。

2.2.2硫酸銨濃度及其流加方式對GC1325發(fā)酵的影響

采用搖瓶發(fā)酵考察了不同初始硫酸銨濃度（25、50、75 g/L）對L-Arg發(fā)酵過程的影響結(jié)果見圖3所示，體系中的硫酸銨的代謝曲線見圖4所示。

圖3　不同的初始濃度硫酸銨對OD值和L-Arg產(chǎn)量的影響Fig.3Effects of different initial ammonium sulfate concentrations on OD value and the yield of L-Arginine

圖4　不同初始濃度硫酸銨的代謝曲線Fig.4The Metabolic profile of different initial ammonium sulfate concentrations

從整個發(fā)酵過程看，初始硫酸銨濃度為25 g/L時，菌體生長較快；而初始硫酸銨濃度為50 g/L時，菌體生長量偏低，這充分說明發(fā)酵液初始硫酸銨濃度過高對菌體生長有一定的抑制作用。但是，初始硫酸銨濃度為25 g/L時，40 h時L-Arg的產(chǎn)量達到最大值9.73 g/L。但40 h～96 h段，雖然菌體中精氨酸合成酶系具有較高的活力，但體系硫酸銨的含量為0，缺少氮源，無法合成精氨酸，L-Arg的產(chǎn)量不再上升。而初始硫酸銨濃度為50 g/L和75 g/L時，在整個發(fā)酵過程中L-Arg產(chǎn)量呈持續(xù)上升趨勢，當(dāng)發(fā)酵至96 h時，初始硫酸銨濃度為75 g/L的L-Arg產(chǎn)量略高于初始硫酸銨濃度為50 g/L的產(chǎn)量，但2種發(fā)酵液中均殘存大量的硫酸銨。

綜合以上分析，初始發(fā)酵液中高濃度硫酸銨對菌體生長有一定的抑制作用，且最終發(fā)酵液中剩余的硫酸銨也較多，損耗較大。而分次添加硫酸銨既可以降低高濃度硫酸銨對菌體生長的抑制作用，又能在發(fā)酵過程中維持較高的硫酸銨濃度來提供菌體的產(chǎn)酸需要。而初始氮源濃度25 g/L時，整個發(fā)酵體系有最大的比生長速率、最大的L-Arg生成速率、最大的葡萄糖消耗速率和最大的硫酸銨消耗速率。因此，初始硫酸銨濃度定為25 g/L，后續(xù)通過連續(xù)流加25%的氨水，使硫酸銨濃度維持在25 g/L的水平，既滿足了菌體合成精氨酸所需的氮源，解除了高濃度氮對菌體生長的抑制，又可以使發(fā)酵體系pH維持在7.0，消除因精氨酸合成引起的體系pH下降對菌體活力的不利影響。

2.3無機鹽對發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

硫酸鎂是細胞內(nèi)L-Arg代謝途徑中很多重要酶的激活劑，如圖5所示。

圖5　不同的無機鹽（硫酸鎂、磷酸二氫鉀）添加量對L-Arg產(chǎn)量的影響Fig.5Effects of different addition of inorganic salts（MgSO4· 7H2O，KH2PO4）on the yield of L-Arginine

缺少了硫酸鎂時菌體內(nèi)酶的活性偏低，長勢微弱，目標產(chǎn)物L(fēng)-Arg的合成也大幅度減少，當(dāng)培養(yǎng)基內(nèi)硫酸鎂的濃度為0.6 g/L時就基本不會影響產(chǎn)量。說明菌體生長的硫酸鎂最低需求量為0.6 g/L。當(dāng)培養(yǎng)基內(nèi)含有1.2 g/L的磷酸二氫鉀時，L-Arg的產(chǎn)量達到最高，低于此值時，菌體的糖代謝動力不足，生長緩慢；而添加量過高，糖代謝過于迅速，過多的葡萄糖被用作菌體細胞生長，不利于L-Arg的積累。因此，選取1.2 g/L的磷酸二氫鉀濃度為宜。

2.4生物素的最佳添加量

在L-Arg合成中加入生物素可利用它對細胞膜通透性的影響，使胞內(nèi)L-Arg的合成前體物谷氨酸不易流出，有利于代謝流多向L-Arg合成的方向流動。如圖6所示。

圖6　不同的生物素添加量對L-Arg產(chǎn)量的影響Fig.6Effects of different addition of biotin on the yield of LArginine

當(dāng)生物素的添加濃度達到100 μg/L，L-Arg的產(chǎn)量達到最大。而生物素添加量過多則會引起產(chǎn)量下降，可能是由于過多的生物素會使菌體生長繁殖時間變長，菌量增多，后續(xù)代謝過程中對氧的消耗嚴重，谷氨酸的分泌下降，因此L-Arg產(chǎn)量也相應(yīng)降低。

3結(jié)論

采用單因素試驗法，確定了黃色短桿菌L-Arg高產(chǎn)突變株GC1325發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)基為：葡萄糖100g/L，（NH4）2SO425 g/L、KH2PO41.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.6 g/L、生物素100 μg/L；發(fā)酵開始后24 h后一次補加葡萄糖50 g/L補充碳源，發(fā)酵過程中連續(xù)流加25%的氨水維持（NH4）2SO4濃度在25 g/L，在此優(yōu)化的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，GC1325獲得的最大產(chǎn)L-Arg量為37.8 g/L，比優(yōu)化前GC1325的L-Arg的產(chǎn)量23.8g/L提高了58.8%。

［1］陳雪嵐，許正宏，陶文沂.產(chǎn)L-精氨酸基因工程菌的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，129（12）：97-102

［2］Kiyoshi N，Hajime Y．Fermentative Production of L-Arginine［J］.A－gricultural and Biological Chemistry，1972，36（10）：1675-1684

［3］張義萍，張偉國.優(yōu)化L-精氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基［J］.發(fā)酵科技通訊，2006（2）：18-20

［4］朱進偉，張偉國.L-精氨酸發(fā)酵代謝調(diào)控的初步研究［J］.食品工業(yè)科技，2008（7）：131-133

［5］賀小賢，孫瑩，陳合.發(fā)酵液中L-精氨酸的檢測方法［J］.食品與藥品，2007（1）：18-20

Optimization of Fermentation Medium for L-Arginine Production with Brevibacterium Flavum

ZHAO Xin1，2，XIAO Yu-ping1，LI Li-ying1
（1.Department of Food and Bioengineering，Guangdong Industry Technical College，Guangzhou 510300，Guangdong，China；2.Center of Guangdong Higher Education for Engineering and Technological Development of Speciality Condiments，Guangzhou 510300，Guangdong，China）

At the liquid culture conditions，the fermentation medium of GC 1325，the high yielding of L-arginine strain mutagenized form brevibacterium flavum optimized using single factor test.Different concentrations of carbon sources，nitrogen sources，inorganic salts，and thiamine effect on the production of L-arginine were studied.The initial concentration of carbon sources，nitrogen sources and additional way were confirmed.The experimental results show that the optimal fermentation medium for GC 1325：glucose 100 g/L，（NH4）2SO425 g/L，KH2PO41.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.6 g/L，biotin 100 μg/L；Glucose（50 g/L）fed once at 24 h and 25%aqueous ammonia fed continuously to maintain the（NH4）2SO4concentration was 25 g/L in the fermentation process.At this optimization of culture conditions，the maximum yield of L-arginine was 37.8 g/L，which was increased by 58.8%.

brevibacterium flavum；fermentation medium；optimization；L-arginine

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.10.031

2014-04-01

趙鑫（1982—），男（漢），講師，博士，研究方向：生物制藥技術(shù)。