李巍

【摘 要】通過實驗來比較水中細(xì)菌總數(shù)測定的三種培養(yǎng)方法，篩選出更靈敏的接種方法——雙層培養(yǎng)法，該方法簡便，實用性強(qiáng)，便于推廣使用。

【關(guān)鍵詞】水中細(xì)菌總數(shù)；測定；改進(jìn)

0.前言

水是微生物廣泛分布的天然環(huán)境，水中微生物種類及數(shù)量因水源不同而異。當(dāng)水體受到污染時，水中微生物的數(shù)量可大量增加。但直接檢查水中的各種病原微生物，方法較復(fù)雜，有的難度大。所以，在實際工作中經(jīng)常以測定細(xì)菌總數(shù)來判斷水的污染程度。細(xì)菌作為水體中主要的微生物類群，在表征水體污染程度等方面發(fā)揮著重要作用。但筆者發(fā)現(xiàn)測定細(xì)菌總數(shù)，在37℃培養(yǎng)24小時開始菌落計數(shù)，發(fā)現(xiàn)計數(shù)結(jié)果總是偏低。通過多次實驗，認(rèn)為從以下幾方面加以改進(jìn)，可以提高細(xì)菌檢出率，減少不確定度。

1.材料與試劑

材料： 高壓蒸汽滅菌器、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、電熱干燥箱、冰箱、滅菌三角瓶、滅菌的具塞三角瓶、滅菌平皿、滅菌吸管、調(diào)溫電爐。

試劑：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、滅菌水。

2.原理

細(xì)菌總數(shù)測定是測定水中需氧菌、兼性厭氧菌和異氧菌密度的方法。因為細(xì)菌能以單獨個體、成雙成對、鏈狀、成簇等形式存在。本實驗應(yīng)用平板計數(shù)技術(shù)測定水中細(xì)菌總數(shù)，通過計數(shù)在一定的培養(yǎng)基平板上生長的菌落數(shù)，來獲得水中細(xì)菌的總數(shù)。細(xì)菌總數(shù)是指lmL或1g檢樣中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)，它反應(yīng)了水樣中活菌的數(shù)量。

3.實驗方法

3.1水樣的稀釋

選擇適宜的稀釋度，以期在平皿上的菌落總數(shù)介于30～300之間。稀釋方法如下：以無菌操作方法吸取10mL充分混勻的水樣，注入盛有90mL滅菌水的三角燒瓶中，混勻制成1：10稀釋液。吸取1：10的稀釋液lmL注入盛有9mL滅菌水的三角燒瓶中，混勻制成1：100稀釋液。按同法依次稀釋成其他的稀釋倍數(shù)。傳統(tǒng)的混勻稀釋液的方法是用吸管反復(fù)吹吸數(shù)次來完成的。而筆者采用的是振搖的方法，即在三角燒瓶中放入滅菌玻璃珠然后振搖稀釋液，以使其充分混勻。而不必用吸管上吹下吸，這樣即省時又省力。

3.2操作方法

（1）傾注法是以無菌操作方法用1mL滅菌吸管吸取充分混勻的水樣注入滅菌平皿中，再傾注約15mL已融化并冷卻到45℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，立即旋搖平皿，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻。待瓊脂冷卻凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，使底面向上，置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24小時。進(jìn)行菌落計數(shù)。其優(yōu)點是：1）通用；2）較易使菌落均勻分布，計數(shù)容易；3）取樣量大，結(jié)果重現(xiàn)性好。缺點是：1）該法不利于嚴(yán)格好氧菌的繁殖生長，分布在培養(yǎng)基內(nèi)的部分細(xì)胞所形成的菌落較小，甚至無法形成菌落，2）加上有些活菌受熱損傷，使檢測到的細(xì)菌總數(shù)偏低。

（2）涂布法是將已熔化的培養(yǎng)基倒入無菌平皿，制成無菌平板，冷卻凝固后，將0.1mL或0.2mL的樣品懸液滴加在固體培養(yǎng)基表面，再用無菌玻璃涂棒將樣品均勻分散至整個培養(yǎng)基表面，待樣品被完全吸收后倒置培養(yǎng)。其優(yōu)點是：1）可以檢測到熱敏性菌體；2）菌落生長在培養(yǎng)基表層，體積大，形態(tài)明顯；3）更適合嚴(yán)格的好氧菌。其缺點是：1）不易使菌落分布均勻，有時菌落過大，導(dǎo)致蔓延生長和互相融合，形成鏈狀、片狀影響計數(shù)；2）等待時間長，涂布棒用酒精火焰灼燒后，需放置數(shù)分鐘等其完全冷卻才能使用；3）0.1～0.2mL水樣涂布在固體培養(yǎng)基表面后需放置約10分鐘等水樣被滲透吸收后才能倒置，因此涂布法的使用并不廣泛，只在特殊情況下使用。

（3）雙層培養(yǎng)法首先制作營養(yǎng)瓊脂平板作為底層培養(yǎng)基：平皿內(nèi)加入適量營養(yǎng)瓊脂，冷卻凝固后備用；然后吸取不同稀釋度水樣1mL，注入上述平板，傾倒少量融化的營養(yǎng)瓊脂作為上層培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)動平板使混合均勻，待水樣滲透、瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平板培養(yǎng)。其優(yōu)點是：克服了傾注法和涂布法的各自缺點，綜合了兩者優(yōu)點。

4.實驗部分

三種方法檢測結(jié)果如下

注：采樣點為崔東河。

檢測結(jié)果比較：雙層培養(yǎng)法菌落計數(shù)約是傾注法2倍，涂布法約是傾注法的1.5～2.5倍。

5.結(jié)果與分析

三種培養(yǎng)方法比較：雙層培養(yǎng)法比涂布法容易，比傾注法靈敏，方法簡便，實用性強(qiáng)，便于推廣使用。細(xì)菌總數(shù)多寡反映水體有機(jī)物污染程度，檢驗意義極大。通過實驗篩選出更靈敏的接種方法—雙層培養(yǎng)法，優(yōu)化稀釋方法可以最大限度促進(jìn)活菌生長，得到比較全面的菌落總數(shù)，真實反映水體狀況，為水質(zhì)評價提供可靠依據(jù)。 [科]