楊　沁　陳夢(mèng)婷　劉　虹　魏艷麗　張向娣（嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江嘉興　314033）

HPLC法測(cè)定紫草中紫草素的含量

楊沁*陳夢(mèng)婷劉虹魏艷麗張向娣
（嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江嘉興314033）

建立高效液相法對(duì)新疆紫草中左旋紫草素的含量測(cè)定方法。色譜條件為Dikma diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.05%三氟乙酸水溶液-乙腈梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為516 nm，柱溫30℃。左旋紫草素進(jìn)樣量在0.32 mg/mL～0.00768 mg/mL（R= 0.9999）的范圍內(nèi)，呈良好線性關(guān)系，平均回收率為97.78%，RSD=1.08%。檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確。

高效液相色譜法紫草素含量測(cè)定

紫草為紫草科紫草屬的多年生草本植物，主要分布于我國(guó)新疆、內(nèi)蒙、四川和云南等地。紫草在我國(guó)具有悠久的藥用歷史，其主要有效成分是以左旋紫草素為代表的萘醌類化合物，左旋紫草素的含量也是目前中國(guó)藥典中紫草含量測(cè)定的指標(biāo)。本文選擇紫草素作為指標(biāo)成分，建立了紫草中左旋紫草素的HPLC測(cè)定方法。

一、儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀，四元泵（美國(guó)Agilent公司）；電子分析天平（北京賽多利斯公司），超聲波清洗器（寧波金達(dá)超聲波儀器廠）；MILLI-Q超純水儀（MILLIPORE公司）；新疆紫草購(gòu)自成都荷花池中藥材專業(yè)市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為為紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma（Royle）Johnst.的干燥根；左旋紫草素對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定所（批號(hào)：110769-200405）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

二、方法與結(jié)果

2.1色譜條件 Dikma diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱溫30℃；流動(dòng)相為0.05%三氟乙酸水溶液-乙腈；流速為1.0 mL/min；梯度洗脫，0～25 min，B相線性由40%改變至90%；25～30 min，B相線性維持在90%，檢測(cè)波長(zhǎng)為516 nm［1］，進(jìn)樣量為20 μL。

2.2方法學(xué)考察

2.2.1對(duì)照品溶液制備 精密稱取左旋紫草素對(duì)照品6.4 mg，置10 mL量瓶中，無水乙醇溶解，制成0.64 mg/mL的貯備液。精密移取5 mL貯備液，加無水乙醇稀釋至刻度，定容至10 mL量瓶中，得左旋紫草素濃度為0.32 mg/mL的對(duì)照品溶液。分別按照上述方法精密移取適量對(duì)照品溶液，用無水乙醇進(jìn)行稀釋分別制得0.16 mg/mL、0.064 mg/mL、0.0384 mg/mL、0.01536 mg/mL和0.00768 mg/mL系列濃度的對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液制備同一批次的新疆紫草干燥至恒重，適當(dāng)粉碎后過篩，精密稱取4 g紫草粉末，置于錐形瓶中，加入48 mL無水乙醇超聲提取2次。合并兩次濾液，旋蒸發(fā)儀低溫濃縮至干。加無水乙醇溶解至刻度，定容于50 mL，搖勻。按照2.1色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定。

2.2.3線性關(guān)系考察對(duì)照品溶液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，按上述色譜條件分別精密吸取20 μL進(jìn)樣，峰面積數(shù)據(jù)利用Excel表格繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），得回歸方程為y=19896x-5.1787（R=0.9999），其中（y）為峰面積、橫坐標(biāo)（x）為進(jìn)樣量。結(jié)果表明，進(jìn)樣量在0.32 mg/mL～0.00768 mg/mL的范圍內(nèi)，峰面積與進(jìn)樣量呈良好線性關(guān)系。

圖1　紫草對(duì)照品HPLC

圖2　紫草提取物HPLC（*：紫草素）

圖3　線性曲線

2.2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液分別在

0，2，4，6，8，12，24 h進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果顯示左旋紫草素RSD=0.43%（n=7），表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定，有關(guān)物質(zhì)符合要求。

2.2.5精密度試驗(yàn)分別精密吸取對(duì)照品溶液（0.064 mg/mL），每次20 μL，按照確定的色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定左旋紫草素的峰面積，并計(jì)算RSD=0.26%，由此可知儀器的精密度良好。

2.2.6加樣回收試驗(yàn)精密稱取已知含量的同一批次紫草藥材6份，分別精密加入0.64 mg/mL左旋紫草對(duì)照品溶液1 mL，按2.2.2項(xiàng)制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示左旋紫草素的平均回收率為97.78%，RSD=1.08%（見表1）。

表1　左旋紫草素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

三、討論

林雄等［2］和伍毅［3］分別采用甲醇-水-磷酸（78：22：0.3，v/v）和甲醇：磷酸（85：15）作為流動(dòng)相測(cè)定了紫草油中左旋紫草素的含量。本實(shí)驗(yàn)考察了不同比例的甲醇-磷酸-水系統(tǒng)和乙腈-三氟醋酸-水系統(tǒng)，最終以0.05%三氟乙酸水-乙腈系統(tǒng)洗脫效果最優(yōu)，能較好的測(cè)定左旋紫草素的含量，測(cè)方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確。

［1］周化更，劉曉華，富志軍.新疆紫草中紫草素的提取方法研究［J］.海峽藥學(xué)，2015，7：011.

［2］林雄，潘旭東，黃燕，等.HPLC測(cè)定紫草油中左旋紫草素的含量［J］.海峽藥學(xué)，2011，23（7）：83-85.

［3］伍毅.HPLC法測(cè)定紫草油中左旋紫草素的含量［J］.中藥新藥與臨床藥理，2005，16（1）：66-68

楊沁（1995.05-），女，嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院2013年本科生

嘉興學(xué)院重點(diǎn)SRT項(xiàng)目基金資助（851714070）