張謙王劍英林智賈佳郭宏濤

（1.深圳技師學院，深圳 518116；2.深圳市綠微康生物工程有限公司，深圳 518055）

華根霉脂肪酶在黑曲霉中的重組表達研究

張謙1王劍英2林智2賈佳2郭宏濤2

（1.深圳技師學院，深圳 518116；2.深圳市綠微康生物工程有限公司，深圳 518055）

將華根霉脂肪酶基因RCL在黑曲霉中進行了重組表達。通過PCR技術分別獲得黑曲霉Pgpd啟動子和RCL-TtrpC融合片段并克隆至質粒pCHAMBIA230，構建出RCL超表達載體pCHAMBIA2302∷Pgpd-RCL-TtrpC。將該載體通過凍融法轉化農桿菌EHA105，進而通過農桿菌介導轉化法轉化黑曲霉，隨機挑選7株轉化子，進行PCR和Southern雜交鑒定，均為陽性。對這7株轉化子進行發(fā)酵和脂肪酶活力測定，結果顯示，所有轉化子均能表達RCL，其中T6轉化子的脂肪酶活力最高，達到71 U/mL。SDS-PAGE分析表明，重組表達的RCL的分子量約為37 kD。

重組表達；華根霉；脂肪酶；黑曲霉；根癌農桿菌

華根霉脂肪酶（Rhizopus chinensis lipase，RCL）是絲狀真菌華根霉（R. chinensis）產生的脂肪酶，其全長ORF由389個氨基酸殘基構成，包含26個氨基酸的信號肽，94個氨基酸的前導肽和269個氨基酸的成熟肽［1］。研究表明，RCL在食品加工領域有重要應用價值，它能夠顯著增加面包的比容、改善面包結構、延緩面包老化，與國內同類產品相比，RCL在改善面包和饅頭的硬度、彈性、膠著性和咀嚼性方面效果更佳，能夠替代傳統(tǒng)的化學改良劑［2，3］。但是，在食品安全方面，華根霉不是一般認為安全（general recognized as safe，GRAS）菌株，因此，它所分泌的脂肪酶不能直接作為食品添加劑。

隨著分子生物學的發(fā)展，RCL的基因被克隆，研究人員在畢赤酵母中實現(xiàn)了RCL的重組表達［1，4］，但是畢赤酵母發(fā)酵過程需要添加甲醇，甲醇是一種劇毒化學物質，微量的甲醇就會導致中樞神經(jīng)損害、眼部損害及代謝性酸中毒［5］，因此以甲醇作為誘導劑生產的RCL仍然不能作為食品添加劑。為了實現(xiàn)RCL在食品加工領域中的廣泛應用，必須選用食品安全菌株來表達RCL。

黑曲霉（Aspergillus niger）是一種重要的工業(yè)微生物，在工業(yè)酶制劑方面應用廣泛，可以產生脂肪酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶等30多種酶制劑［6］。此外，黑曲霉用于食品釀造和加工方面已經(jīng)有上百年的歷史，因此被美國FDA認定為GRAS菌株，可以用于食品和藥品級酶制劑的生產［7］。由于黑曲霉具備出色的蛋白質分泌能力、高度的安全性、成熟的發(fā)酵及后處理工藝，因此，常被作為宿主菌用以表達異源酶基因［8-10］。然而，目前尚沒有黑曲霉表達RCL的研究報道。

本研究構建了黑曲霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動子（Pgpd）驅動的RCL超表達載體，并利用農桿菌介導轉化法（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）轉化黑曲霉，探索了RCL在黑曲霉中的重組表達方法，研究結果對促進RCL在食品加工領域的應用有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

黑曲霉（Aspergillus niger，CICC 2475）購至中國菌種保藏中心；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α和根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105均為深圳市綠微康生物工程有限公司保存；載體pCHAMBIA2302，由上海交通大學唐克軒教授惠贈；華根霉基因已構建在pMD18-T（simple）上，命名為pMD18-T∷RCL由本公司保存；Hybond-N+尼龍膜和Southern雜交試劑盒購至GE公司；限制性內切酶、DNA聚合酶、連接酶、pMD18-T 載體等均購自TaKaRa公司；其余所有化學試劑均為分析純；所用引物由Invitrogen公司合成。

PCR 儀購至Bio-Rad公司；5417R 型臺式冷凍離心機購至德國Eppendorf 公司；Southern雜交管和雜交爐購至Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 載體構建 以黑曲霉基因組DNA為模板，利用引物Pgpd-F/ Pgpd-R擴增黑曲霉的甘油醛三磷酸脫氫酶啟動子（Pgpd）；片段經(jīng)Sal I/Pme I消化克隆至二元表達載體pCHAMBIA2302的相應位點。

以質粒pAN7-1為模板，以TtrpC-F/ TtrpC-R為引物擴增構巢曲霉色氨酸合成酶終止子；以pMD18-T∷RCL為模板，以RCL-F/RCL-R為引物擴增華根霉編碼序列RCL；然后以RCL-F/TtrpC-R為引物，利用重疊延伸PCR，構建出RCL-TtrpC融合片段；片段經(jīng)Spe I/Pme I消化后克隆至二元表達載體pCHAMBIA2302的相應位點；構建出最終的RCL超表達載體pCHAMBIA2302∷Pgpd-RCL-TtrpC，并經(jīng)測序確認正確。所有引物序列，見表1。

表1 PCR引物序列

1.2.2 根癌農桿菌介導的黑曲霉遺傳轉化 利用凍融法將構建的pCHAMBIA2302∷Pgpd-RCL-TtrpC表達載體轉化根癌農桿菌EHA105。黑曲霉的轉化方法參照de Groot等［11］報道的方法，有部分步驟改進。首先，將含有RCL超表達載體的EHA105接種于MM培養(yǎng)基（含卡拉霉素100 μg/mL，鏈霉素100 μg/mL）過夜培養(yǎng)；吸取適量的培養(yǎng)物離心去上清，并用IM液體培養(yǎng)基稀釋至OD600=0.15左右，然后再培養(yǎng)至OD600=0.5-0.6。制備新鮮的黑曲霉孢子懸液，并稀釋成106個/mL。隨后取上述孢子懸液與EHA105等體積混合，均勻涂布到鋪有玻璃紙的CM平板上。共培養(yǎng)60 h后，轉移到PDA篩選培養(yǎng)基（含有潮霉素100 μg/mL，頭孢菌素300 μg/mL）上，等待轉化子長出。將抗性轉化子挑出，接種到新的PDA篩選培養(yǎng)基，如此連續(xù)傳代3次；如穩(wěn)定傳代，則初步認定為黑曲霉轉化子。

1.2.3 轉化子的鑒定 隨機挑選7株黑曲霉轉化子進行擴大培養(yǎng)，抽提基因組DNA，利用引物RCLF/TtrpC-R對轉化子進行PCR鑒定；對PCR鑒定為陽性的轉化子，進行Southern雜交分析，Southern雜交的具體步驟參見GE公司的Southern雜交試劑盒說明書（RPN3680）。

1.2.4 轉化子的發(fā)酵 使用YPD培養(yǎng)基，在25℃、250 r/min條件下，分別對出發(fā)菌CICC 2475和鑒定為陽性的黑曲霉轉化子發(fā)酵3 d。然后對發(fā)酵產物離心收集上清，以橄欖油為底物，采用NaOH滴定法測定脂肪酶活力［12］。酶活力定義為每分鐘分解底物生成1 μmol脂肪酸的酶量為一個活力單位。

1.2.5 SDS-PAGE分析 樣品的濃縮：取發(fā)酵液200 μL，冰浴10 min，加入三氯乙酸（TCA，50%）50 μL，冰浴30 min，然后10 000 r/min離心15 min，棄上清液，沉淀加入0.2 mL預冷的丙酮洗滌，然后離心，棄上清，并置于真空泵抽中干燥10 min；備用。電泳：濃縮后的樣品溶解于25 μL的Tris緩沖液中（100 mmol/L，pH6.8），然后加入6 μL Loading Buffer（5×），進行SDS-PAGE電泳分析，電泳完畢后用考馬斯亮藍R250染色過夜，然后脫色至獲得清晰的電泳條帶為止。

2 結果

2.1 RCL超表達載體的構建

以黑曲霉基因組為模板，PCR獲得黑曲霉Pgpd啟動子（圖1-A），克隆至pCHAMBIA2302，構建出中間載體pCHAMBIA2302∷Pgpd。然后通過重疊延伸PCR獲得RCL-TrpC融合片段（圖1-B），克隆至pCHAMBIA2302∷Pgpd，構建出RCL的超表達載體pCHAMBIA2302∷Pgpd-RCL-TtrpC（圖1-C）。表達載體經(jīng)測序確認正確后轉化農桿菌EHA105，獲得了含RCL超表達載體的工程農桿菌EHA105。

圖1 RCL超表達載體的構建

2.2 黑曲霉轉化子的鑒定

用含有載體pCHAMBIA2302∷Pgpd-RCL-TtrpC的農桿菌EHA105侵染黑曲霉，獲得了黑曲霉轉化子，對轉化子進行鑒定。隨機挑選7株轉化子，進行DNA的抽提，以轉化子的基因組為模板以出發(fā)菌CICC 2475（未轉化的黑曲霉菌株）為對照，進行PCR鑒定。結果（圖2-B）顯示，所有轉化子均出現(xiàn)大小為1.9 kb的擴增產物，與陽性對照一致；而未轉化的黑曲霉菌株沒有出現(xiàn)任何條帶，初步證實所挑選轉化子均為陽性轉化子。對擴增產物進行測序，測序結果與目標序列一致，進一步證實所得轉化子的為陽性克隆。

為了分析所得轉化子中的目標基因拷貝數(shù)和整合位點，利用Southern雜交技術對上述陽性轉化子進行進一步研究。Southern雜交結果（圖2-C）顯示，所有轉化子均為單拷貝，7株轉化子的雜交片段大小各不相同，表明目標基因的插入位點是隨機的。

2.3 黑曲霉轉化子的發(fā)酵

將上述7株轉化子進行發(fā)酵，發(fā)酵完畢后離心，取上清液進行脂肪酶活力測定。脂肪酶活力測定采用NaOH滴定法，測定結果如圖3。

測定結果顯示，各轉化子的發(fā)酵液中均檢測到了較強的脂肪酶活力，而對照菌（未轉化的黑曲霉菌株）的發(fā)酵液中卻幾乎檢測不到脂肪酶活力，說明RCL在黑曲霉中得以重組表達，其中產量最高的T6轉化子可以達到71 U/mL。

圖2 黑曲霉轉化子的鑒定

圖3 黑曲霉轉化子的發(fā)酵酶活力測定

2.4 發(fā)酵液的電泳分析

以未轉化的黑曲霉為對照，對產量最高的T6轉化子的發(fā)酵液進行SDS-PAGE分析，結果（圖4）顯示在箭頭所指位置出現(xiàn)了明顯的蛋白條帶，而未轉化的黑曲霉發(fā)酵液中沒有，說明這一條帶即為重組表達的RCL。根據(jù)軟件Gel-pro 3.0計算，該條帶的分子量約為37.5 kD。

圖4 T6發(fā)酵液的SDS-PAGE分析

3 討論

RCL雖然在食品加工中有重要應用價值，但是一直沒有一種符合食品安全標準的RCL生產菌株，嚴重限制了RCL在食品加工中的應用。針對這一問題，本研究探索了RCL在黑曲霉中重組表達的可能性，獲得了表達RCL的黑曲霉基因工程菌，建立了RCL在黑曲霉中的重組表達方法，研究結果對構建RCL的黑曲霉工業(yè)生產菌，促進RCL在食品工業(yè)中的應用有重要意義。

本研究選用了黑曲霉自身的強啟動子Pgpd作為RCL的啟動子，這有利于實現(xiàn)RCL的高效表達。甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（gpd）是很多生物的管家基因，其表達水平較高，有的可以達到胞內可溶蛋白的5%［13］，因此其啟動子（Pgpd）是較強的啟動子，經(jīng)常用來啟動各種基因的表達［14，15］。黑曲霉自身的Pgpd啟動子相較于其它異源的Pgpd啟動子更容易與黑曲霉相關轉錄因子結合，實現(xiàn)RCL的高效表達。

黑曲霉的遺傳轉化可以采用PEG-介導的原生質體轉化法（PMT）和農桿菌介導轉化法（ATMT）。PMT需要制備原生質體，過程繁瑣，轉化效率低，轉化子多不穩(wěn)定；而ATMT不用制備原生質體，過程簡便、高效，轉化子穩(wěn)定［16］。所以本研究采用了ATMT法轉化黑曲霉，并獲得了轉化子。對隨機挑選7株轉化子進行鑒定，均為陽性，且為單拷貝，這與農桿菌介導轉化其它真菌的特征一致［11，17］，單拷貝插入是轉化子穩(wěn)定傳代的重要原因。轉入的RCL表達盒隨機插入到黑曲霉基因組中，這也與之前的研究結果一致［18］。

轉化子的發(fā)酵和酶活力分析結果證實了RCL的重組表達，不同轉化子的酶活力有差異，這可能是表達盒插入的位點不同導致的［19］。T6轉化子的發(fā)酵酶活力最高，達到71 U/mL，這與畢赤酵母的表達水平尚有一定差距［1］，還需要進一步提高黑曲霉表達RCL的產量。進一步提高黑曲霉的RCL產量可從以下3方面改進：（1）根據(jù)黑曲霉偏愛密碼子重新合成RCL基因并進行高效表達，偏好密碼子對酶的表達量影響顯著［20，21］。（2）對轉化子的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，培養(yǎng)基配方對酶的發(fā)酵產量影響較大［22］，可以采用RSM法、主成分分析法等優(yōu)化培養(yǎng)基配方。（3）可以將RCL表達盒定點整合到黑曲霉基因組中的轉錄活躍區(qū)，整合位點對基因的表達量影響明顯，當目標基因整合到異染色質區(qū)域時，轉錄量低，甚至不轉錄，因此重組酶產量低，甚至沒有酶活力［23］，可以利用同源重組技術將RCL整合到轉錄活躍區(qū)。最后，對T6轉化子的發(fā)酵液進行SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)其重組表達的RCL分子量約為37.5 kD，與酵母重組表達的RCL分子量相近［1］。

4 結論

本研究以黑曲霉內源的Pgpd為啟動子構建了RCL的超表達載體pCHAMBIA2300∷Pgpd-RCLTtrpC，并采用農桿菌介導轉化法，將RCL表達盒插入到黑曲霉基因組中，轉化子中RCL拷貝數(shù)多為單拷貝，整合方式為隨機整合，轉化子均能分泌RCL，其中T6轉化子的脂肪酶活力最高，可以達到71 U/mL，重組表達的RCL分子量為37.5 kD。

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（責任編輯 李楠）

Recombinant Expression of Rhizopus chinensis Lipase in Aspergillus niger

Zhang Qian1Wang Jianying2Lin Zhi2Jia Jia2Guo Hongtao2
（1.Shenzhen Institute Technology，Shenzhen 518116；2 .Shenzhen Leveking Bio-engineening Co.，Ltd，Shenzhen 518055）

This article carried out the recombinant expression of Rhizopus chinensis lipase（RCL）gene in Aspergillus niger. Promoter of Pgpd from A. niger and RCL-TtrpC fusing fragment were respectively obtained by PCR and further cloned to plasmid pCHAMBIA2302 to generate the RCL over-expression vector pCHAMBIA2302∷Pgpd-RCL-TtrpC. The resulting vector was introduced into Agrobacterium tumefaciens EHA105， and then transformed into A. niger through the mediation of A. tumefaciens. Seven randomly selected transformants were analyzed by PCR and Southern blot. As a result， all the transformants were found to be positive. Then， the seven transformants were subjected to fermentation and lipase assay， and the results showed that all the transformants secreted recombinant RCL， among which transformant T6 produced the highest lipase specific activity， reaching up to approximately 71 U/mL. The fermentation broth was further analyzed by SDS-PAGE，which revealed the molecular weight of the recombinant RCL was 37 kD.

recombinant expression；Rhizopus chinensis；lipase；Aspergillus niger；Agrobacterium tumefaciens

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.024

2014-08-27

深圳市科技創(chuàng)新委員會技術創(chuàng)新計劃項目（CXZZ20130425111508558）

張謙，男，高級工程師，碩士，研究方向：工業(yè)微生物及發(fā)酵工程；E-mail：qianz50@hotmail.com