王星星池哲

（1.甘肅省科學(xué)技術(shù)情報(bào)研究所，蘭州 730000；2.中國海洋大學(xué)，青島 266000）

甲基對(duì)硫磷水解酶的釀酒酵母表面展示及在甲基對(duì)硫磷降解中的應(yīng)用

王星星1池哲2

（1.甘肅省科學(xué)技術(shù)情報(bào)研究所，蘭州 730000；2.中國海洋大學(xué)，青島 266000）

PCR擴(kuò)增假單胞菌WBC-3的甲基對(duì)硫磷水解酶基因，插入表面展示質(zhì)粒pYD1的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建pYD1-MPH重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母EBY100，2%半乳糖誘導(dǎo)甲基對(duì)硫磷水解酶表達(dá)，并利用免疫熒光檢測(cè)甲基對(duì)硫磷水解酶在釀酒酵母細(xì)胞表面的表達(dá)展示。研究了表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶的酶學(xué)性質(zhì)和酵母工程菌對(duì)水體中甲基對(duì)硫磷的降解效果。結(jié)果表明成功構(gòu)建具有全細(xì)胞甲基對(duì)硫磷水解酶催化活性的酵母工程菌，經(jīng)2%半乳糖誘導(dǎo)48 h，表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶比酶活力為18.2 U/mg細(xì)胞干重。表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶的最適作用pH為9.5，最適作用溫度為30℃，在pH4.0-10.5之間和45℃以下穩(wěn)定性較好，Mn2+、Co2+、Zn2+、Ca2+、Hg2+、K+、Ni2+對(duì)表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶活性有激活作用，Na+、Fe3+、Ag+對(duì)展示酶活力有抑制作用。工程菌在1 h內(nèi)對(duì)淡水中20 mg/L的甲基對(duì)硫磷的降解率在80%以上。

甲基對(duì)硫磷水解酶；表面展示；釀酒酵母；甲基對(duì)硫磷降解

甲基對(duì)硫磷是一種高毒的有機(jī)磷農(nóng)藥，使用后殘留期長，是一種持久性有機(jī)污染物［1］，在國內(nèi)水源和食物中時(shí)有檢出［2，3］。甲基對(duì)硫磷作為一種神經(jīng)毒劑，可通過抑制生物體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的活性而造成乙酰膽堿累積，引起神經(jīng)功能紊亂，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致個(gè)體死亡，對(duì)生物體有較大的毒害作用［4］。

甲基對(duì)硫磷水解酶（Methyl parathion hydrolase，MPH）是由甲基對(duì)硫磷水解酶基因編碼的酯酶，可破壞甲基對(duì)硫磷中的磷酯鍵，使甲基對(duì)硫磷的毒性下降約120倍［5］。因此，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)高效、廉價(jià)的甲基對(duì)硫磷水解酶制劑是解決環(huán)境中甲基對(duì)硫磷殘留的一種非常具有潛力的方法。目前國內(nèi)外已分離得到許多甲基對(duì)硫磷降解菌，克隆了編碼甲基對(duì)硫磷水解酶的基因并且進(jìn)行了異源表達(dá)［6-11］。但是分離純化甲基對(duì)硫磷水解酶操作繁瑣，成本較高，而且會(huì)造成酶活性的損失；而直接利用全細(xì)胞進(jìn)行甲基對(duì)硫磷的降解，卻因細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的酶受到細(xì)胞膜的阻隔不能與胞外底物充分接觸而限制了酶活性的發(fā)揮［12］。

微生物表面展示技術(shù)是近年來發(fā)展較快的一種基因工程技術(shù)，其通過將外源蛋白與特定的載體蛋白（錨定蛋白）基因序列融合，使外源蛋白表達(dá)錨定在微生物細(xì)胞表面［13］，在全細(xì)胞催化、蛋白分離純化、環(huán)保領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。因此，利用表面展示技術(shù)將甲基對(duì)硫磷水解酶分泌并錨定在微生物細(xì)胞表面，無需酶的純化，并且突破細(xì)胞膜的阻礙使酶和底物充分接觸，成為開發(fā)高效、簡便的全細(xì)胞甲基對(duì)硫磷水解酶的有效手段。

目前，國內(nèi)外研究者利用大腸桿菌表面展示系統(tǒng)和假單胞菌表面展示系統(tǒng)進(jìn)行包括甲基對(duì)硫磷水解酶在內(nèi)的有機(jī)磷水解酶的表面展示［14-17］，酵母表面展示系統(tǒng)在有機(jī)磷水解酶表達(dá)展示中的研究較少。酵母表面展示系統(tǒng)是一種常見的展示系統(tǒng)，其錨定蛋白為酵母細(xì)胞壁中存在的一類甘露糖蛋白，稱為細(xì)胞壁蛋白，其中包括釀酒酵母的α和a凝集素。這類蛋白通過共價(jià)鍵與酵母細(xì)胞壁的葡聚糖相連接［13］。相較于細(xì)菌表面展示系統(tǒng)，酵母表面展示系統(tǒng)具有較完善的蛋白質(zhì)分泌機(jī)制和翻譯后修飾，以及安全無毒等優(yōu)點(diǎn)，利用酵母表面展示系統(tǒng)構(gòu)建安全、高效的有機(jī)磷農(nóng)藥降解工程菌株用于有機(jī)磷農(nóng)藥污染治理具有廣闊的研究空間。釀酒酵母是酵母表面展示的宿主細(xì)胞之一，為食品級(jí)微生物，遺傳操作方便，安全、容易培養(yǎng)，適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，適用于開發(fā)安全、經(jīng)濟(jì)的全細(xì)胞甲基對(duì)硫磷水解酶。本研究將來源于假單胞菌Pseudomonas sp. WBC-3的甲基對(duì)硫磷水解酶表達(dá)展示于釀酒酵母細(xì)胞表面，檢測(cè)全細(xì)胞酶的活性，并且進(jìn)行展示酶的酶學(xué)性質(zhì)研究以及全細(xì)胞酶對(duì)水體中甲基對(duì)硫磷的降解研究，為開發(fā)新型、高效的全細(xì)胞甲基對(duì)硫磷水解酶奠定基礎(chǔ)，為甲基對(duì)硫磷的生物降解提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 質(zhì)粒pYD1和其受體菌釀酒酵母EBY100購自美國Invitrogen公司；質(zhì)粒pET20b帶有假單胞菌WBC-3的甲基對(duì)硫磷水解酶基因（GenBank accession No.AY251554），由武漢病毒所張先恩研究員提供；E.coli DH5α，購自北京TIANGEN生物公司；pMD19-T simple vector購自寶生物（大連）有限公司（TaKaRa）。

1.1.2 分子生物學(xué)酶及試劑 限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I、T4 DNA連接酶購自FERMENTAS（MBI）公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自北京TIANGEN生物公司；LA Taq DNA聚合酶、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA Marker購自寶生物（大連）有限公司（TaKa-Ra）；甲基對(duì)硫磷純品（Dr. Ehrenstorfer GmbH，Germany）購自青島艾科寶生物技術(shù)有限公司，純度為99.5%，配制為10 mg/mL的母液（溶于甲醇）；小鼠抗6×His單克隆抗體購于美國Clontech公司；異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體購自北京TIANGEN生物公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 甲基對(duì)硫磷水解酶基因的克隆及鑒定 根據(jù)假單胞菌WBC-3的甲基對(duì)硫磷水解酶基因序列和表面展示質(zhì)粒pYD1多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物mphpyd1-se和mphpyd1-an，在上下游引物中分別引入EcoR I和Xho I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，引物序列分別 為：mphpyd1-se：GAATTCGCCGCACCGCAGGTG（下劃線處為EcoR I酶切位點(diǎn)，mphpyd1-an：CTCGAGCTTGGGGTTGACGACCG（下劃線處為Xho I酶切位點(diǎn)）。以質(zhì)粒pET20b為模板，mphpyd1-se和mphpyd1-an為引物進(jìn)行擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增體系為：2×GC buffer 25.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 8.0 μL；20 μmol/L引物（mphpyd1-se、mphpyd1-an）各1.0 μL，質(zhì)粒pET20b 1.0 μL，LA Taq DNA聚合酶 0.5 μL，ddH2O 13.5 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。膠回收PCR擴(kuò)增條帶，與pMD19-T simple Vector連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α。挑取白斑克隆培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用EcoR I、Xho I雙酶切驗(yàn)證。選取酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒，送博尚生物技術(shù)（上海）有限公司測(cè)序、比對(duì)。將測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pMD19-T simple-MPH。

1.2.2 pYD1-MPH重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將質(zhì)粒pMD19-T simple-MPH和pYD1進(jìn)行EcoR I和Xho I雙酶切，將酶切回收后的甲基對(duì)硫磷水解酶基因片段和質(zhì)粒pYD1連接、轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，再對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行EcoR I和Xho I雙酶切鑒定，將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為pYD1-MPH。

1.2.3 釀酒酵母EBY100轉(zhuǎn)化及MPH的誘導(dǎo)表達(dá) 按照Invitrogen公司說明書方法將重組質(zhì)粒pYD1-MPH轉(zhuǎn)化釀酒酵母EBY100，同時(shí)以轉(zhuǎn)入不含MPH基因片段的pYD1作為陽性對(duì)照，在添加了亮氨酸的選擇培養(yǎng)基平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子。挑取轉(zhuǎn)化子接種于2.0%葡萄糖的YNB-CAA的培養(yǎng)基中30℃振蕩培養(yǎng)過夜，菌體用PBS緩沖液洗滌后，重懸于含2.0% D-半乳糖的YNB-CAA液體培養(yǎng)基中25℃振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。每隔12 h取樣測(cè)定展示表達(dá)的酶活，以含pYD1空質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子作對(duì)照。

1.2.4 表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶活性測(cè)定 表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶活力測(cè)定參照Yu等［10］的方法進(jìn)行。反應(yīng)體系為1 000.0 μL，其中含6.0 μL 10.0 mg/mL甲基對(duì)硫磷母液、929.0 μL 40.0 mmol/L 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH9.5）和65.0 μL菌體濃度為1.6×108個(gè)細(xì)胞/mL的菌懸液。30℃反應(yīng)10 min，加入200.0 μL 10% HNO3終止反應(yīng)。離心反應(yīng)液后取 500.0 μL上清液，加入5.0 mL 0.5 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH10.0）混勻，405 nm下測(cè)定吸光值。OD405值反映了甲基對(duì)硫磷水解產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚的生成量。表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶酶活力單位定義為：在30℃、pH9.5的條件下，每分鐘水解1.0 μmol底物即產(chǎn)生1.0 μmol對(duì)硝基苯酚所需要的表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶酶量。比活力為每毫克菌體干重具有的甲基對(duì)硫磷水解酶活力，單位為U/mg細(xì)胞干重。

1.2.5 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè) 取誘導(dǎo)表達(dá)48 h相當(dāng)于含OD600值為2.0的菌液，以轉(zhuǎn)入空載體pYD1的轉(zhuǎn)化子和EBY100分別作為陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，分別以小鼠抗6×His單克隆抗體和異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體作為抗體進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。具體試驗(yàn)操作方法參照Yue等［18］的方法進(jìn)行。

1.2.6 表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶的酶學(xué)性質(zhì)研究 分別用pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0的酶反應(yīng)緩沖液取代酶活測(cè)定方法中的緩沖液，按照1.2.4的方法測(cè)定酶活，確定酶的最適反應(yīng)pH。將細(xì)胞懸液分別置于上述pH值的緩沖液，4℃保溫24 h，測(cè)定剩余酶活力，確定酶的pH穩(wěn)定性。

按照1.2.4的方法，分別在20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70℃水浴反應(yīng)10 min，測(cè)定展示酶活性，確定酶的最適反應(yīng)溫度。將細(xì)胞懸液分別在上述溫度保溫1 h，按照1.2.4的方法，測(cè)定剩余酶活，以放置于4℃的酵母細(xì)胞的酶活力作為對(duì)照（100%），確定酶的溫度穩(wěn)定性。

1.2.7 金屬離子對(duì)表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶活性的影響 將表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶的酵母細(xì)胞懸液與不同金屬離子混合，金屬離子終濃度為5.0 mmol/L?；旌弦河?.0℃下保溫1 h，然后按照1.2.4的方法，測(cè)定剩余酶活。對(duì)照為加同等體積蒸餾水的細(xì)胞酶活，根據(jù)剩余酶活判斷金屬離子對(duì)展示酶活性的影響。

1.2.8 水體中甲基對(duì)硫磷降解研究 在1 000.0 mL的三角瓶中加入500.0 mL甲基對(duì)硫磷濃度為20.0 mg/L的淡水，水體的pH為其自然pH和全細(xì)胞酶作用的最適pH，再加入適量的全細(xì)胞酶，使菌體終濃度為3×107個(gè)細(xì)胞/mL。充分混勻，30℃、180 r/min振蕩反應(yīng)1 h，檢測(cè)對(duì)硝基苯酚的生成量，計(jì)算甲基對(duì)硫磷的降解率。反應(yīng)結(jié)束后離心收集菌體用于下一次降解試驗(yàn)，并測(cè)定每輪反應(yīng)后全細(xì)胞酶的剩余活力，以第一次反應(yīng)前全細(xì)胞酶活力作為對(duì)照（100%）。

2 結(jié)果

2.1 甲基對(duì)硫磷水解酶基因片段的擴(kuò)增和重組質(zhì)粒pYD1-MPH的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增后得到903 bp的特異性條帶（圖1），克隆入pMD19-T-simple Vector，EcoR I、Xho I酶切驗(yàn)證正確后測(cè)序分析，結(jié)果與假單胞菌WBC-3的甲基對(duì)硫磷水解酶基因序列（GenBank accession No.AY251554）相一致。質(zhì)粒pMD19-T simple-MPH與質(zhì)粒pYD1雙酶切，回收MPH基因片段和pYD1載體片段，連接、轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，陽性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒EcoR I、Xho I雙酶切驗(yàn)證結(jié)果見圖2，質(zhì)粒pYD1-MPH被切為兩個(gè)片段，小片段為MPH基因片段，大片段為pYD1片段，表明重組質(zhì)粒pYD1-MPH構(gòu)建成功。

圖1 甲基對(duì)硫磷水解酶基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖2 重組質(zhì)粒pYD1-MPH EcoR I、Xho I雙酶切鑒定

2.2 表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶活力的測(cè)定

挑取驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)測(cè)定展示酶活力，以含pYD1空質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行對(duì)照。結(jié)果表明陽性轉(zhuǎn)化子在誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h時(shí)酶活最高，為（18.2±1.1）U/mg細(xì)胞干重。而轉(zhuǎn)化入空表面展示質(zhì)粒pYD1的釀酒酵母EBY100沒有甲基對(duì)硫磷水解酶活力。

2.3 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)

質(zhì)粒pYD1含有6×His標(biāo)簽，可以利用鼠抗6×His單克隆抗體作為一抗，異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體作為二抗，對(duì)重組酵母細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。從圖3中可以看到，轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pYD1-MPH和空載體pYD1的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞表面可以觀察到熒光，而未轉(zhuǎn)化菌株EBY100則檢測(cè)不到熒光。說明目的蛋白展示到了釀酒酵母EBY100的表面，達(dá)到了表面展示的目的。

圖3 免疫熒光檢測(cè)表面展示的甲基對(duì)硫磷水解酶

2.4 表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶最適反應(yīng)pH值和pH值穩(wěn)定性

從圖4可以看出，表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶的最適作用pH為9.5，在pH4.0-10.5之間酶的穩(wěn)定性較好，在pH4.0-10.5的緩沖液中4℃下處理24 h后，其仍能保持80%以上的活性。

2.5 表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性

圖5的結(jié)果表明，表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶的最適作用溫度為30℃。在45℃以下穩(wěn)定性較好，在45℃保溫1 h仍能保留80.0%的活性，但在高于45℃時(shí)活性下降很快，在55℃保溫1 h后表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶幾乎完全失活。

圖4 pH對(duì)表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶的活性和穩(wěn)定性的影響

圖5 溫度對(duì)表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶的活性和穩(wěn)定性的影響

2.6 金屬離子對(duì)表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶活力的影響

如表1所示，5.0 mmol/L的Mn2+對(duì)表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶的激活作用最顯著，使展示酶的活力提高將近3倍，Co2+對(duì)展示酶也有顯著的激活作用，酶活力提高兩倍多。Zn2+、Ca2+、Hg2+、K+、Ni2+對(duì)表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶也有激活作用，但是Na+、Fe3+、Ag+對(duì)展示酶活力有抑制作用。Mg2+、Cu2+、Fe2+、Ba2+、Li+對(duì)展示酶活力沒有明顯的影響。

表1 金屬離子對(duì)表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶活力的影響

2.7 水體中甲基對(duì)硫磷降解研究

全細(xì)胞酶在1 h內(nèi)對(duì)不同pH淡水中20.0 mg/L甲基對(duì)硫磷的降解率均可達(dá)到80%以上，受水體pH的影響較小（圖6）。全細(xì)胞酶重復(fù)使用3次后，仍能保持70%以上的活性（表2）。

圖6 不同pH的淡水中甲基對(duì)硫磷的降解率

表2 全細(xì)胞酶的重復(fù)利用性

3 討論

由于表面展示技術(shù)將外源蛋白錨定在微生物細(xì)胞表面，可直接利用全細(xì)胞進(jìn)行催化反應(yīng)，避免了酶的分離純化，并且酶與底物充分接觸，不受細(xì)胞膜的阻隔，因此近年來，表面展示技術(shù)在有機(jī)磷農(nóng)藥降解的研究應(yīng)用中發(fā)展迅速。目前國內(nèi)用于包括甲基對(duì)硫磷水解酶在內(nèi)的有機(jī)磷水解酶表面展示的宿主細(xì)胞多集中于大腸桿菌、假單胞菌［14-17］，酵母表面展示系統(tǒng)在有機(jī)磷水解酶表達(dá)展示中的研究很少，甲基對(duì)硫磷水解酶在釀酒酵母中的表面展示尚未有報(bào)道。本研究成功將假單胞菌WBC-3的甲基對(duì)硫磷水解酶展示在釀酒酵母EBY100細(xì)胞表面，構(gòu)建了表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶的酵母工程菌株，其甲基對(duì)硫磷水解酶比酶活為18.2 U/mg細(xì)胞干重。

本研究中的表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶最適作用pH值為9.5，最適作用溫度為30℃，而假單胞菌WBC-3所產(chǎn)甲基對(duì)硫磷水解酶的最適作用pH和最適作用溫度值為11.0、40℃［19］，這可能是由于表面展示重組表達(dá)的甲基對(duì)硫磷水解酶與錨定蛋白融合表達(dá)以及在表達(dá)時(shí)發(fā)生N-糖基化造成的［20］。Yang等［11］在大腸桿菌BL21中重組表達(dá)的甲基對(duì)硫磷水解酶在25-35℃和pH7.0-9.0時(shí)能保持90%以上的活性，本研究中，表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶在pH4.0-10.5和45℃以下穩(wěn)定性較好，在25-35℃和pH7.0-9.0能保持約90%的活性。說明本研究中的全細(xì)胞酶具有良好的穩(wěn)定性，在不同溫度、pH的環(huán)境條件下不易變性失活，而且較非表面展示表達(dá)的甲基對(duì)硫磷水解酶更經(jīng)濟(jì)、方便。

金屬離子對(duì)本研究中表面展示的甲基對(duì)硫磷水解酶活性具有一定影響，其中加入5.0 mmol/L的Mn2+可使展示酶比酶活達(dá)到71.9 U/mg細(xì)胞干重。Co2+、Zn2+、Ca2+、Hg2+、K+、Ni2+對(duì)展示酶均有激活作用，Na+、Fe3+、Ag+對(duì)酶活力有抑制作用，Mg2+、Cu2+、Fe2+、Ba2+、Li+對(duì)酶活力沒有明顯影響。楚曉娜等［19］研究發(fā)現(xiàn)不同金屬離子對(duì)假單胞菌WBC-3所產(chǎn)天然甲基對(duì)硫磷水解酶的活性也有影響，因此推測(cè)該酶為金屬酶。通過對(duì)該酶三維結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，該酶的活性中心由Zn2+和Cd2+組成［21］。據(jù)報(bào)道，有機(jī)磷水解酶是一種金屬酶，具有由雙Zn2+或Co2+組成的活性中心，活性中心的金屬離子可以被Ni2+、Ca2+、Mn2+、Cd2+取代而保持活性［22］。因此推測(cè)表面展示的甲基對(duì)硫磷水解酶活性中心的Zn2+和Cd2+可能也可以被相應(yīng)的金屬離子取代而使活性發(fā)生改變。

本研究的全細(xì)胞酶對(duì)水體中甲基對(duì)硫磷具有良好的降解效果，受水體pH的影響較小，而且操作穩(wěn)定性較好，可多次重復(fù)利用，具有一定的實(shí)際應(yīng)用潛力。但是本研究構(gòu)建的酵母工程菌其甲基對(duì)硫磷水解酶的表達(dá)和展示必須要經(jīng)過2%的半乳糖的誘導(dǎo)，不利于全細(xì)胞酶投入生產(chǎn)；質(zhì)粒pYD1上攜帶有抗生素抗性基因，酵母工程菌在實(shí)際應(yīng)用過程中存在抗生素抗性基因擴(kuò)散的潛在危險(xiǎn)。因此，本研究構(gòu)建的酵母工程菌成為具有實(shí)用性的全細(xì)胞催化劑還需要進(jìn)一步的探索。通過質(zhì)粒改造使目的基因的表達(dá)不再需要誘導(dǎo)劑，并且移除抗生素抗性基因，同時(shí)嘗試選用不同的表面展示錨定蛋白，探索不同錨定蛋白對(duì)酶表達(dá)和活性的影響，進(jìn)一步提高表面展示酶的活性，將是以后構(gòu)建安全、高效、適用的表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶工程菌研究的方向。

4 結(jié)論

本研究將假單胞菌WBC-3的甲基對(duì)硫磷水解酶在酒精酵母細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)展示，構(gòu)建了具有全細(xì)胞甲基對(duì)硫磷水解酶催化活性的酵母工程菌。表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶的比酶活為18.2 U/mg細(xì)胞干重，最適作用pH和最適作用溫度為9.5、30℃，在pH4.0-10.5之間和45℃以下穩(wěn)定性較好。Mn2+、Co2+、Zn2+、Ca2+、Hg2+、K+、Ni2+對(duì)展示酶有激活作用，Na+、Fe3+、Ag+對(duì)展示酶活力有抑制作用。工程菌在1 h內(nèi)對(duì)淡水中20 mg/L的甲基對(duì)硫磷的降解率在80%以上。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Surface Display of Methyl Parathion Hydrolase on Saccharomyces cerevisiae and Its Application in Degradation of Methyl Parathion

Wang Xingxing1Chi Zhe2
（1. Institute of Science and Technology Information of Gansu，Lanzhou 730000；2.Ocean University of China，Qingdao 266000）

The methyl parathion hydrolase（MPH）gene of Pseudomonas sp.WBC-3 was amplified by PCR and cloned into the multiple cloning site of the surface display vector pYD1 to construct a recombinant plasmid pYD1-MPH. Then plasmid pYD1-MPH was transformed into Saccharomyces cerevisiae EBY100. The 2% galactose was used to induce the expression of MPH on the cell surface of EBYl00， and the display of MPH on the cell surface of S.cerevisiae was confirmed by immunofluorescence. The characteristic of the displayed MPH and degradation effect of methyl parathion in water by the engineered yeast were also investigated. The result showed that the engineered yeast strain， which have a whole cell catalytic activity of MPH， was successfully constructed. The activity of MPH displayed on the yeast cells was 18.2 U/mg of cell dry cells by the induction of 2% galactose for 48 h. The displayed MPH had the optimal pH of 9.5 and the optimal temperature of 30℃， respectively and was stable in the pH range of 4.0-10.5 and up to 45℃. The displayed MPH was stimulated by Mn2+，Co2+，Zn2+，Ca2+，Hg2+，K+，Ni2+， and was inhibited by Na+，F(xiàn)e3+，Ag+. The engineered yeast strain could hydrolyze over 80% of 20.0 mg/L methyl parathion in tap water in 1 h.

methyl parathion hydrolase；surface display；Saccharomyces cerevisiae；methyl parathion degradation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.026

2014-08-06

甘肅省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（145RJZA042）

王星星，女，助理研究員，研究方向：污染生態(tài)學(xué)；E-mail：mmwxx1105@163.com