陳美玲 聶彬 姜?jiǎng)灼?劉桂瓊

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，武漢 430070）

雞neurexophilin 1基因在畢赤酵母中的表達(dá)

陳美玲 聶彬 姜?jiǎng)灼?劉桂瓊

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，武漢 430070）

Neurexophilin 1是母雞子宮陰道結(jié)合部位的差異表達(dá)基因。根據(jù)雞nxph1的序列，結(jié)合畢赤酵母密碼子的偏好性，合成nxph1基因，設(shè)計(jì)引物以合成基因?yàn)槟０?，擴(kuò)增其去除信號(hào)肽的DNA序列△nxph1，將合成的nxph1基因及去除信號(hào)肽的nxph1基因片段△nxph1分別插入pPICZαA真核表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA/nxph1和去除信號(hào)肽的重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA/△nxph1，電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115，陽(yáng)性菌用終濃度為1%的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳和Western blot檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果表明重組菌成功分泌雞NXPH1蛋白和去除信號(hào)的△NXPH1蛋白，大小約29 kD，為探索NXPH1在母雞生殖道內(nèi)的功能奠定基礎(chǔ)。

nxph 1；畢赤酵母；基因表達(dá)

Neurexophilin（NXPH）是一種從大鼠和牛的腦部分離純化的神經(jīng)糖蛋白，其成熟肽29 kD，因其與神經(jīng)元表面蛋白Iα（neurexin Iα）緊密結(jié)合而命名［1］。哺乳動(dòng)物至少含4個(gè)與NXPH相關(guān)的基因，分別是nxph1、nxph2、nxph3和nxph4，這4種基因在不同動(dòng)物不同組織中的表達(dá)不一致，如人類可表達(dá)4種基因，而鼠類則只表達(dá)nxph1、nxph3和nxph4基因，且只有NXPH1和NXPH3可以與neurexin Iα結(jié)合［2］。朱金金等［3］發(fā)現(xiàn)nxph1是雞子宮陰道結(jié)合部的差異表達(dá)基因，且該基因在高受精率組母雞子宮陰道交接部的表達(dá)高于低受精率組，推測(cè)其可能與精子貯存相關(guān)。劉桂瓊等［4］也發(fā)現(xiàn)在人工授精后，母雞貯精腺表達(dá)神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)特異表達(dá)的Neurexophilin1基因，而高受精力母雞貯精腺Neurexophilin1 表達(dá)量高于低受精力母雞，因此神經(jīng)調(diào)控可能參與貯精腺內(nèi)的精子貯存。本研究根據(jù)酵母基因表達(dá)的密碼子偏好改造雞nxph1基因，在畢赤酵母GS115中表達(dá)該基因，以期為后續(xù)研究NXPH 1蛋白的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

真核表達(dá)載體pPICZαA、畢赤酵母GS115菌株為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室郭愛(ài)珍教授課題組惠贈(zèng)；克隆載體PMD-18T購(gòu)自大連寶生物公司（TaKaRa）公司；大腸桿菌DH5α菌株購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；

ZeocinTM購(gòu)自Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；T4 DNA連接酶、TEMED、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ、SacⅠ均購(gòu)于TOYOBO公司；neurexophilin 1抗體購(gòu)自美國(guó)R&D公司。

1.2 方法

1.2.1 Nxph1基因合成和引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank公布的雞nxph1基因（XM-418683）mRNA編碼序列，結(jié)合畢赤酵母密碼子的偏好性優(yōu)化序列，在基因的兩端添加EcoRⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，序列長(zhǎng)為833 bp，序列依次為保護(hù)性堿基、EcoRⅠ酶切位點(diǎn)、氨基酸的編碼序列813 bp、NotⅠ酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基。依據(jù)優(yōu)化后的堿基序列設(shè)計(jì)一對(duì)可擴(kuò)增去除NXPH1蛋白信號(hào)肽的特異性引物P1和P2，并在引物序列的兩端分別添加EcoRⅠ和NotⅠ兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，其擴(kuò)增產(chǎn)物為770 bp，其中氨基酸的編碼序列長(zhǎng)750 bp，將該序列命名為△nxph1。優(yōu)化基因序列和引物由北京金唯智公司合成。

1.2.2 Nxph1基因的序列鑒定 以合成的nxph1基因?yàn)槟０澹謩e以P1/P2為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸 30 s，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。2%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物。DNA凝膠回收試劑盒（北京莊萌生物公司）回收PCR產(chǎn)物，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α，提取質(zhì)粒后用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定，陽(yáng)性克隆菌液送上海生工測(cè)序。

1.2.3 酵母表達(dá)載體的構(gòu)建 將△nxph1質(zhì)粒、合成的基因nxph1和酵母表達(dá)載體pPICZαA用 EcoRⅠ和NotⅠ在37℃條件下雙酶切3 h，2%的瓊脂糖凝膠電泳，回收酶切產(chǎn)物，T4 DNA連接酶16℃連接過(guò)夜，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA/ nxph1和pPICZαA/△nxph1。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選菌落培養(yǎng)提質(zhì)粒，用通用引物5' AOX和3' AOX進(jìn)行PCR 鑒定，用 EcoRⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，陽(yáng)性克隆菌液送上海生工測(cè)序。

1.2.4 構(gòu)建重組nxph1的酵母菌株 用 SacⅠ線性化重組質(zhì)粒pPICZαA/ nxph1 和pPICZαA/△nxph1，取制備好的GS115感受態(tài)50 μL與10 μL線性化的pPICZαA/nxph1、pPICZαA/△nxph1質(zhì)粒充分混勻后轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的0.2 cm電擊杯中，放入Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀中1 500 V、50 μF和500 μs電擊，立即加入1 mL冰凍的山梨醇液，冰浴靜止10 min，菌液30℃孵育1.5 h，離心后棄上清液，取100 μL混合沉淀涂布在含有Zeocin（100 μg/mL）的YPD平板上，30℃培養(yǎng)至出現(xiàn)白色單菌落。挑選白色單菌落培養(yǎng)，采用“煮-凍-煮”的方法提取酵母基因組，用通用引物擴(kuò)增，1 % 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.5 NXPH1在酵母中的表達(dá) 陽(yáng)性酵母重組質(zhì)粒菌液接種BMGY培養(yǎng)基，30℃、220 r/min培養(yǎng)20-24 h。室溫6 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用100 mL的BMMY培養(yǎng)基懸浮，30℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，每隔24 h添加100 %甲醇使終濃度為1.0 %，持續(xù)誘導(dǎo)96 h，每次添加甲醇時(shí)取2 mL的菌液，12 000 r/min離心5 min，取上清至新的離心管中 -20℃保存。按照BCA蛋白濃度定量試劑盒（北京索萊寶生物）測(cè)定表達(dá)蛋白的濃度，選擇誘導(dǎo)72 h的上清液進(jìn)行真空冷凍干燥，凍干后的蛋白于-20℃長(zhǎng)期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western blot檢測(cè) 將100 μL的三氯乙酸加入到1 mL的表達(dá)上清，4℃過(guò)夜。12 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入1 mL預(yù)冷的丙酮，-20℃靜止30 min，離心棄上清，室溫晾干獲得濃縮蛋白。向離心管中加入100 μL的2×SDS-PAGE Loading Buffer，將離心管在沸水中煮10 min，取10 μL做Tricine-SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色，同時(shí)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上進(jìn)行Western blot分析。

2 結(jié)果

2.1 △nxph1的PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)2 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，可以看出在750 bp附近有一特異性的DNA條帶，與預(yù)期目的產(chǎn)物（770 bp）相符（圖1）。將PCR產(chǎn)物連接T載體，陽(yáng)性克隆再用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定，在2 000 bp和750 bp有特異性條帶（圖2），分別是T載體片段和△nxph1目的基因片段，將此陽(yáng)性克隆的菌液進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，確定為目的基因片段。

圖1 △nxph1 PCR產(chǎn)物

圖2 △nxph1陽(yáng)性克隆的雙酶切

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

用 EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pPICZαA/ nxph1 和pPICZαA/△nxph1，酶切的重組質(zhì)粒pPICZαA/ nxph1應(yīng)在約3 500 bp處和813 bp處有特異性的條帶，酶切的重組質(zhì)粒pPICZαA/△nxph1應(yīng)在約3 500 bp處和750 bp處有特異性的條帶，圖3顯示在3 500 bp處和700-1 000 bp處分別有兩條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA/ nxph1 和pPICZαA/nxph1的酶切圖

以5'AOX和3'AOX為引物，以重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA/nxph1和pPICZαA/△nxph1為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)到擴(kuò)增出的目的片段大小在1 000-1 500 bp之間（圖4）。目的基因序列大小為分別為813 bp和750 bp，載體自身序列為588 bp，故擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小約1 300 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物片段與預(yù)測(cè)片段一致，可以進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)。

圖4 重組質(zhì)粒pPICZαA/ nxph1 和pPICZαA/△nxph1的PCR檢測(cè)

將PCR鑒定和雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒pPICZαA/ nxph1和pPICZαA/△nxph1送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果證明目的基因片段已正確插入到載體pPICZαA中。

2.3 重組酵母菌的鑒定

重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA/ nxph1和 pPICZαA/△nxph1轉(zhuǎn)入到畢赤酵母GS115后，以5'AOX和3'AOX為引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，在1 000-1 500 bp處有一條特異性條帶（圖5），擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小約1 300 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物片段與預(yù)測(cè)片段一致，說(shuō)明目的基因片段已整合入酵母基因組。

圖5 pPICZαA/ nxph1 和pPICZαA/△nxph1在GS115中的PCR鑒定

2.4 Tricine-SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)結(jié)果

陽(yáng)性重組菌用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，將表達(dá)產(chǎn)物濃縮變性后進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳，用pPICZαA空酵母載體作對(duì)照，電泳完畢后考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)在約29 kD處有一條清晰的細(xì)條帶，對(duì)照組沒(méi)有條帶。選擇誘導(dǎo)72 h的蛋白做Western blot，結(jié)果（圖6）顯示在相應(yīng)位置有特異的免疫性條帶。

圖6 重組蛋白的Tricine-SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)

2.5 蛋白濃度檢測(cè)結(jié)果

蛋白標(biāo)準(zhǔn)品繪制完成蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2=0.992，說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)曲線較為理想，可以用于測(cè)定蛋白樣品濃度。表1是分別對(duì)誘導(dǎo)48 h、72 h、96 h的重組蛋白pPICZαA/ nxph1和 pPICZαA/ △nxph1的濃度檢測(cè)結(jié)果，從表中可以看出去除信號(hào)肽的NXPH1表達(dá)量相對(duì)更高一些，且在72 h蛋白的濃度達(dá)到最高。

表1 蛋白濃度測(cè)定結(jié)果

3 討論

巴斯畢赤酵母作為真核機(jī)體對(duì)產(chǎn)生蛋白的翻譯可以進(jìn)行修飾，另外有利于表達(dá)蛋白的分離純化［5］。pPICZαA載體是含有強(qiáng)啟動(dòng)子AOX1和α-交配因子信號(hào)肽序列，能夠引導(dǎo)外源蛋白的分泌，可以用ZeocinTM抗性基因?qū)χ亟M子直接進(jìn)行篩選，同時(shí)載體上His標(biāo)簽可以進(jìn)行親和純化［6-8］。本試驗(yàn)選用pPICZαA作為表達(dá)載體，攜帶外源基因nxph 1進(jìn)入酵母表達(dá)系統(tǒng)并整合入酵母GS115的染色體，利用pPICZαA表達(dá)載體上的信號(hào)肽序列引導(dǎo)NXPH1蛋白的分泌，使NXPH1高效表達(dá)，也證實(shí)外源基因在畢赤酵母中能得到高表達(dá)。

1987年，Hoekema等報(bào)道了酵母所偏愛(ài)的25個(gè)密碼子，所以在合成外源基因時(shí)可以根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛(ài)性，在保持翻譯時(shí)氨基酸不變的情況下對(duì)密碼子進(jìn)行突變以獲得高效表達(dá)的蛋白。2002年，Sinclair和Choy在畢赤酵母中表達(dá)人源葡糖腦苷酯酶時(shí)，通過(guò)對(duì)C+G含量的調(diào)整和密碼子的優(yōu)化證明其蛋白產(chǎn)量比天然基因提高很多倍［9］。張朝春和梁偉鋒［10］根據(jù)人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素（hNT-3）的基因序列，根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏愛(ài)性把編碼氨基酸的密碼子進(jìn)行了替換，發(fā)現(xiàn)蛋白表達(dá)量提高11倍。Delroisse等［11］研究發(fā)現(xiàn)沒(méi)有改造的赤擬盜羧酯酶基因在巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中并不表達(dá)，但是當(dāng)按照酵母密碼子的偏好性改造之后，可以檢測(cè)到改基因的表達(dá)。Shumiao等［12］研究也發(fā)現(xiàn)通過(guò)優(yōu)化密碼子之后，可以大幅度提高瑞氏木霉纖維素內(nèi)切酶基因的表達(dá)量。本研究根據(jù)GenBank上公布的雞nxph1基因mRNA編碼序列，結(jié)合畢赤酵母密碼子的偏好性優(yōu)化序列，將優(yōu)化后的雞nxph1全長(zhǎng)基因序列和去除信號(hào)肽的雞△nxph1基因序列分別定向插入酵母載體，電轉(zhuǎn)化入GS115，轉(zhuǎn)化后陽(yáng)性菌用抗性進(jìn)行篩選，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)的產(chǎn)物為NXPH1，表明我們已經(jīng)通過(guò)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)雞NXPH1蛋白。Thill等［13］研究發(fā)現(xiàn)，如果在外源基因的自身信號(hào)肽引導(dǎo)下表達(dá)蛋白，則酵母細(xì)胞自身信號(hào)肽的表達(dá)量不高，而且分泌效率也低，因此在構(gòu)建質(zhì)粒時(shí)通常將外源基因的信號(hào)肽去除。龔婷等［14］對(duì)雞白介素-2基因進(jìn)行去除信號(hào)肽和全基因的誘導(dǎo)表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，在相同條件下去除信號(hào)肽的重組質(zhì)粒的表達(dá)量高。馬亮等［15］也在弓形蟲表面抗原 SAG3基因的原核表達(dá)發(fā)現(xiàn)，不含信號(hào)肽的SAG3 基因，所構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中具有高效表達(dá)。另有研究表明，利用外源基因的信號(hào)肽引導(dǎo)表達(dá)的蛋白較易降解，利用酵母細(xì)胞對(duì)外源蛋白的信號(hào)肽識(shí)別后對(duì)蛋白進(jìn)行傳送，則表達(dá)的外源蛋白更穩(wěn)定［16］。所以本試驗(yàn)中同時(shí)選取了去除信號(hào)肽的△nxph1基因和nxph1全基因，轉(zhuǎn)化到酵母中，蛋白的表達(dá)量分別為0.563 mg/mL和0.480 mg/mL，結(jié)果也證實(shí)去除信號(hào)肽的NXPH1表達(dá)量相對(duì)更高一些。

4 結(jié)論

本研究根據(jù)GenBank上公布的雞nxph1的序列，結(jié)合畢赤酵母碼子的偏好性，成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA/ nxph1和去除信號(hào)肽的重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA/△nxph1，并成功獲得大小約29 kD雞NXPH1蛋白和去除信號(hào)的△NXPH1蛋白，且去除信號(hào)肽的NXPH1表達(dá)量相對(duì)更高。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Expression of Chicken Neurexophilin 1 Gene in Pichia pastoris

Chen Meiling Nie Bin Jiang Xunping Liu Guiqiong
（College of Animal Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070）

Neurexophilin 1 is the differentially expressed gene at the chicken utero-vaginal junction. According to the mRNA sequence of chicken nxph1 and codon bias of Pichia pastoris， the modified DNA sequence for chicken nxph1 which encodes the same amino acid sequence as that of chicken nxph1were synthesized. Specific primers were designed to amplify part of the synthesized DNA sequence whose expression product has no signal peptide. The two sequences were inserted into pPICZαA vector to construct the recombinant pPICZαA/ nxph1 and pPICZαA/△ nxph1（without signal peptide）， and then the recombinant plasmids were transfected into Pichia pastoris GS115 by electroporation. The positive recombinant strains were inducted to express protein by addition of 1 % methanol. The expression protein was displayed on the Tricine-SDS- PAGE electrophoresis and Western blot. The result showed that chicken NXPH1 protein and △NXPH1 protein were successfully expressed， and the molecular weight of the protein was approximately 29 kD， which provided foundations for analyzing functions of NXPH1 in chicken reproductive tract.

nxph 1；Pichia pastoris；gene expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.030

2014-07-07

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31071088）

陳美玲，女，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖；E-mail：chenmeiling064@126.com

劉桂瓊，副教授，E-mail：liuguiqiong@mail.hzau.edu.cn