嚴濤 郗洪生

（江蘇恒豐強生物技術有限公司，海門 226100）

微生物合成γ-聚谷氨酸的相關基因、合成機理及發(fā)酵的研究進展

嚴濤 郗洪生

（江蘇恒豐強生物技術有限公司，海門 226100）

γ-聚谷氨酸（γ-PGA）是一種天然的氨基酸聚合物，由于其水溶性好、可生物降解、食用，以及對人類、動物和環(huán)境無毒等特點，因此，在環(huán)境、醫(yī)藥、食品和化妝品、飼料添加劑等領域有廣泛的應用前景。主要是對微生物合成γ-PGA所采用的菌株、相關基因、合成機理及發(fā)酵方面進行綜述。

γ-PGA；基因；機理；發(fā)酵

隨著人們綠色環(huán)保意識的加強，尋找綠色、無污染的新型材料越來越受到關注，而γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）由于水溶性好，可生物降解與食用，以及對人類、動物和環(huán)境無毒的特點，目前已成為生物多聚物中的研究熱點之一。γ-PGA是一種水溶性可生物降解的新型綠色生物材料，由D-或L-谷氨酸通過α-氨基和γ-羧基通過γ-酰胺鍵結合而成的陰離子聚合物。γ-PGA的結構式如圖1所示。

圖1 γ-PGA的結構式

γ-PGA具有可食用性、無毒性、成膜性、黏結性、保濕性等特點，其應用非常廣泛，既可應用于醫(yī)藥、食品和化妝品中，又可以作為保水劑及水果、蔬菜的防凍劑、保鮮劑，還可以作為污水處理的絮凝劑、重金屬螯合劑。更重要的是，還可應用于飼料添加劑方面，提高動物對鈣、鐵、磷等微量元素的吸收，減少動物排泄物對環(huán)境造成的污染。γ-PGA的合成方法有化學合成法、提取法和微生物發(fā)酵法。其中化學合成法包括傳統(tǒng)的肽合成法和二聚體縮合法，由于產物純度難以控制、副產物比較多，同時產物的相對分子質量比較小，所以限制了該方法的應用；提取法是從日本傳統(tǒng)食品納豆（類似中國的豆豉）中分離得到γ-PGA，由于納豆中成分復雜，γ-PGA的含量不穩(wěn)定，使該方法不能廣泛運用。目前合成γ-PGA的主要方法是微生物發(fā)酵法［1，2］，該法工藝相對簡單，產物分離純化容易，微生物發(fā)酵法在近幾年得到了廣泛的采用與快速發(fā)展。本文主要是對微生物合成γ-PGA所采用的菌株、相關基因、合成機理及發(fā)酵方面進行綜述。

1 合成γ-PGA的菌株

γ-PGA是最早于1933年在炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）的莢膜上發(fā)現(xiàn)的，主要功能是保護細菌免受外界不利環(huán)境的影響。據報道［3］，表皮葡萄球菌（Saphylococcus epidermidis）也能合成γ-PGA，合成的γ-PGA結合在細胞壁上。另外，3種古生菌，如嗜鹽球菌（Planococcus halophilus），鹽藻芽孢八疊球菌（Sporosarcina halophila）和亞洲嗜鹽堿桿菌（Natrialba asiatica）也能合成γ-PGA，用來降低細菌周圍的鹽濃度。目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種真核γ-PGA合成生物為腔腸動物（Cnidaria）。

通過微生物來發(fā)酵合成γ-PGA，其研究主要集中在芽孢桿菌屬細菌的炭疽芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等［4］菌株上。根據細胞生長的營養(yǎng)要求，按是否需要L-谷氨酸，可以把γ-PGA合成菌分為兩大類［5］：一類是谷氨酸依賴型，即培養(yǎng)時需要L-谷氨酸才能積累γ-PGA，這類菌種主要有Bacillus anthracis、Bacillus subtilis MR-141、Bacillus licheniformis ATCC-9945、Bacillus subtilis IFO3335和Bacillus subtilis F-2-01等；另一類是谷氨酸非依賴型，即培養(yǎng)時不需要L-谷氨酸也能積累γ-PGA的，如Bacillus subtilis 5E、Bacillus licheniformis A35、Bacillus subtilis TAM-4等［6］。21世紀以來，篩選可以高效合成γ-PGA的微生物，受到越來越多的學者的關注，曹明飛等［7］成功從土壤中分離到一株γ-PGA合成菌Bacillus licheniformis NK-03，其合成的γ-PGA中L-谷氨酸單體達到98%，在已報道的同種菌株L-谷氨酸單體含量中尚屬最高。而發(fā)現(xiàn)的能夠大量合成γ-PGA的多種芽孢桿菌都具有潛在的工業(yè)應用價值，本研究組合成γ-PGA所用到的菌株為枯草芽孢桿菌。

2 微生物合成γ-PGA的相關基因研究

合成γ-PGA的相關基因，根據其命名可分為cap（Capsule）和pgs（Polyglutamate synthase）。前者是將γ-PGA做為莢膜的結構組成部分，為結構型，其代表菌株為Bacillus anthracis；后者是將產生的γ-PGA分泌到胞外，為分泌型，其代表菌株類型為Bacillus subtilis。在Bacillus anthracis的菌體中包含兩個質粒，即pXO1（108 kb）和pXO2（951 kb），最初將有關PGA編碼的相關基因定位在Bacillus anthracis的pXO2質粒上，稱之為cap BCA，這也是Makino等［8］在1989年首次報道編碼γ-PGA生物合成過程的相關基因研究，他們通過基因互補技術，在質粒pXO2上鑒定出呈簇狀分布的3個順反子，并確定其排列順序為：cap B、cap C和cap A，如圖2-A所示。通過對cap BCA這3個蛋白的氨基酸序列進行分析、定位及對理化處理的敏感性，推測這些屬于膜交聯(lián)酶。后來Urushibata等［9］將cap BCA基因克隆轉到大腸桿菌（Escherichia coli）中進行表達發(fā)現(xiàn)，cap B是一個重疊基因，能編碼2個蛋白cap B和cap B'，cap BCA酶以膜結合蛋白形式存在。另外，在cap BCA基因簇下游發(fā)現(xiàn)了編碼γ-聚D-谷氨酸解聚酶的基因dep，該基因主要是菌體在饑餓條件下，啟動該基因的表達來降解PGA為菌體提供氮源。

圖2 炭疽芽孢桿菌莢膜基因cap BCA（A）與枯草芽孢桿菌合成酶基因pgs BCA（B）

Ashiuchi等［10］從Bacillus subtilis IFO3336基因組文庫中，篩選到編碼γ-PGA合成酶復合體的克隆，其能在胞外合成更高分子量的γ-PGA。此合成基因包含：pgs B、pgs C和pgs A（也有學者稱為yws C、ywt A和ywt B）3個基因，排列成簇，如圖2-B所示。下游ywt C基因功能未知，可能是編碼γ-PGA解聚酶pgd S（也有學者稱為ywt D）基因的先導小蛋白，Bacillus subtilis IFO3336中pgs BCA基因與Bacillus anthracis的cap BCA基因同源性分別為66%、77%和50%。Cao等［11］篩選到一株谷氨酸非依賴型γ-PGA合成菌，即解淀粉芽孢桿菌LL3，并從菌體中克隆到pgs BCA的PGA合成基因，通過與谷氨酸依賴型Bacillus subtilis IFO3336序列比對發(fā)現(xiàn)，pgs B、pgs C和pgs A 這3個基因的相似性分別為81.39%、83.33%和73.8%。Uruchibata等［12］從Bacillus subtilis IFO16449中獲得包含4個開放閱讀框的4.2 kb片段，Northern雜交顯示其組成一個操縱子，其中yws C（pgs B）、ywt A（pgs C）和ywt B（pgs A）為γ-PGA合成必要的基因；Western雜交發(fā)現(xiàn)yws C蛋白由44 kD的 yws C和33 kD的yws C'兩部分組成，且由同向重疊的yws C基因編碼，然而兩蛋白具體功能尚不清楚。pgs BCA系統(tǒng)是分泌型芽孢桿菌菌體內唯一的γ-PGA合成體系［13］，石峰等［14］從Bacillus subtilis ZJU-7的基因組中擴增得到合成γ-PGA的pgs BCA，通過把pTrc99A作為載體轉化到大腸桿菌JM109中，構建出來的工程菌大腸桿菌JM109能合成γ-PGA；有些枯草芽孢桿菌，如Bacillus subtilis 168，雖然含有pgs BCA這3個基因，但是由于γ-PGA合成酶操縱子受不同啟動子控制，在Bacillus subtilis 168菌體中轉錄水平太低，使其不能合成γ-PGA，而馬婕等［15］從Bacillus subtilis 168基因組中獲得合成γ-PGA的3個基因，即yws C、ywt A和ywt B，這3個基因被連接酶連接后，導入到pTrcHisA中，電轉化至轉錄水平比較高的大腸桿菌TOP10及大腸桿菌BL21（DE3）中進行表達，結果顯示宿主菌都具備了γ-PGA的合成能力。

Xu等［16］從Bacillus subtilis IFO 16449 菌中克隆出了一個新基因，命名為ywt D，其功能是編碼可降解γ-PGA的一種酶。經DNA序列分析將其定位于ywt ABC和yws C基因的相連的下游，并與yws C和ywt ABC構成控制γ-PGA生物合成的一個操縱子，如圖2-B所示。同時還證明，ywt D基因與編碼DL-內肽酶的基因序列部分相同。純化的這種酶，具有降解γ-PGA的功能，降解后可產生兩種酶解產物，一種高分子質量產物（490 kD，100%由L-谷氨酸組成）；另一種低分子質量產物（11 kD，其中D-谷氨酸與L-谷氨酸的比為80∶20）。再用羧肽酶G分析證明這兩種產物，這種ywt D酶為一種只降解γ-PGA的D-與L-谷氨酸所形成的γ-谷氨酰鍵，為γ-DL-谷氨?；饷浮Ｍ跤媯サ龋?7］通過在pET-28b（+）大腸桿菌表達系統(tǒng)中克隆表達Bacillus licheniformis ATCC9945A的ywt D基因，采用SDSPAGE和Western Blot方法檢測目的蛋白的表達，并進行體外酶解試驗驗證其活性，體外酶解試驗表明該表達產物具有降解γ-PGA的活性。筆者在用Bacillus subtilis發(fā)酵合成γ-PGA時，在發(fā)酵后期，發(fā)酵液變得十分黏稠，但當超濾后，高黏度的發(fā)酵液若不及時提取γ-PGA，放置幾日后，則黏度逐漸消失，這是由于γ-DL-谷氨?；饷笇Ζ?PGA降解的原因。目前，雖然已經得知γ-PGA合成的必需基因（即cap BCA和pgs BCA），但是其合成的各個蛋白的具體功能，仍然不清楚，需要后期進一步的研究。

3 γ-PGA合成機理的研究

3.1 γ-PGA中碳骨架的來源

組成γ-PGA碳骨架是來源于葡萄糖中的碳，還是來自谷氨酸中的碳，不同菌體其來源不盡相同。有學者［18］通過13C標記葡萄糖，對Bacillus subtilis NX-2中γ-PGA分子鏈中的碳骨架進行了跟蹤分析，結果發(fā)現(xiàn)葡萄糖作為碳源大部分用于能量代謝和菌體合成，只有少部分參與了γ-PGA合成，而谷氨酸則為γ-PGA單體的主要來源；Cromwick和Gross［19］用13C標記檸檬酸和谷氨酸作為培養(yǎng)基碳源，通過核磁共振技術對該菌合成γ-PGA的代謝途徑進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)檸檬酸和谷氨酸均作為前體參與了γ-PGA碳骨架的合成；另外，在Bacillus subtilis MR-141［20］中，除了35%的外源14C-谷氨酸整合入γ-PGA，還有6%的14C-葡萄糖也整合入γ-PGA。由此可知，不同微生物，其γ-PGA碳骨架來源有種屬特異性，根據這一現(xiàn)象有助于為培養(yǎng)基成分的設計及γ-PGA的合成提供理論依據。

3.2 γ-PGA的聚合機制研究

最早推測出γ-PGA合成機制的是Troy等［21］首先在Bacillus licheniformis 中發(fā)現(xiàn)的，其合成機制為：首先，ATP激活L-谷氨酸，然后由ATP脫去ppi形成的AMP，與谷氨酸在γ位結合，形成谷氨酰-γ-AMP；然后該物質與一種帶-SH的酶或者受體（如一些硫脂，暫以X代稱）結合，并隨后異構化為谷氨酰-X；然后谷氨酰連接到γ-PGA片段上，并脫去X，完成γ-PGA片段的延伸。

后來，Ashiuchi等［13］在一株Bacillus subtilis 中分離到了細胞膜成分，在ATP和D-谷氨酸存在下體外合成了γ-PGA。但他們發(fā)現(xiàn)該菌在合成γ-PGA時，ATP水解形成的是ADP，而非AMP，而由于cap B的表達蛋白cap B屬氨基連接酶，他們提出了另一條合成機制。即ATP被ATP水解酶水解為ADP與Pi，然后磷酸基團結合到小分子γ-PGA的C末端，之后D-或者L-谷氨酸的氨基端與C端磷酸化了的小分子γ-PGA發(fā)生親核攻擊，生成Pi，在γ-PGA合成酶的作用下，延伸γ-PGA鏈。但是，D-谷氨酸依賴型的ATP酶活性要比L-谷氨酸依賴型的ATP酶活性高，這似乎解釋了合成酶系對底物的偏好性，使得γ-PGA中的D-谷氨酸單體比例偏高。但此機制仍有待進一步證明，如小分子γ-PGA究竟多大，發(fā)生親核攻擊的具體位置等。筆者認為，雖然不同的學者得到的合成γ-PGA的機制不盡相同，但是不同的微生物，由于其生物特性及代謝調控的不同，其合成γ-PGA的機制也應該不完全相同。

圖3 γ-PGA的合成途徑及調控示意圖

3.3 γ-PGA合成的調控研究

由于cap BCA和pgs BCA的基因序列相似度很高，而且微生物合成γ-PGA屬于結合型還是游離型，主要是取決于另外的基因cap D和pgs S，所以推測cap BCA和pgs BCA基因控制的γ-PGA合成調控機理相同［22］，而且cap BCA基因合成的γ-PGA主要是炭疽芽孢桿菌莢膜的主要成分，一般不用其大量生產γ-PGA，對其調控的研究很少有報道。因此，這里簡述一下pgs BCA基因合成γ-PGA的調控研究。

Mader等［23］在Bacillus subtilis中發(fā)現(xiàn)高濃度的磷酸化的DegU能夠活化pgs B，C，A的轉錄。2005年，Stanley等［24］報道稱在Bacillus subtilis中，調控蛋白ComP-ComA、DegS-DegU、GegQ和SwrA對γ-PGA的合成是必需的。他們將DegQ和SwrA分別敲除發(fā)現(xiàn)，這兩個基因任一的敲除都將導致γ-PGA不能合成。而后對DegQ進行了反轉錄PCR發(fā)現(xiàn)，高濃度的DegQ對yws C（與pgs B相同）的轉錄起調節(jié)作用，而SwrA對其轉錄有細微的影響，所以研究者猜測SwrA主要在轉錄后起調節(jié)作用。而之前的研究已經表明，ComP-ComA和DegS-DegU都能影響DegQ的轉錄，所以他們提出了一種可能的調節(jié)途徑，如圖3所示。Kimura等［25］于2009年發(fā)現(xiàn)pgs B基因上游的一段非編碼區(qū)對其表達起重要作用。他們將lac Z與pgs B融合，組成融合基因，并通過檢測Lac Z的表達來定量表征pgs B的表達情況，然后用一種外切酶從pgs B上游-811開始切除，進而研究上游非編碼區(qū)域對pgs B的表達影響。結果表明，-721（+1為轉錄起始位點）之后的非編碼區(qū)對融合基因的表達起重要作用，猜測可能是ComA或者DegU需要與該段區(qū)域結合，進而對γ-PGA合成基因進行調控。另外，Bacillus subtilis 168被廣泛用于γ-PGA調控研究，因為該菌是為數不多的、擁有全套的γ-PGA合成基因卻不生產γ-PGA的菌株。

綜 上 所 述，ComP-ComA、DegS-DegU、DegQ和SwrA對γ-PGA的合成都是必需的。其中ComPComA，DegS-DegU蛋白對基因degQ進行調控，進而調節(jié)DegQ的轉錄，影響γ-PGA合成酶的合成，間接影響pgs B，C，A的轉錄，SwrA則主要作用于pgs B，C，A的轉錄后調控，即主要調控γ-PGA合成酶的活性。而pgs B上游的非編碼區(qū)對pgs B的表達也有重要影響。

表1 γ-聚谷氨酸部分合成菌及發(fā)酵條件

4 微生物合成γ-PGA發(fā)酵的研究

通過微生物來發(fā)酵生產γ-聚谷氨酸，其發(fā)酵影響因素，如碳氮源、通氧量、攪拌速度、金屬離子、微量元素、前體物質、生物素等，對不同菌株生產γ-聚谷氨酸的影響是不同的。表1［26-34］列出了幾株谷氨酸依賴型和非依賴型菌株的培養(yǎng)基配方、發(fā)酵周期和γ-聚谷氨酸產量、單體D/L-谷氨酸比例及分子量大小。以發(fā)酵菌株、發(fā)酵培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件、發(fā)酵方式3個方面來簡述微生物發(fā)酵合成γ-聚谷氨酸的研究進展。

4.1 發(fā)酵合成γ-PGA的菌株研究

由于不同菌株，其本身的特性，決定了其生長代謝的不同，因此發(fā)酵合成γ-PGA的能力也不同，因此，很多研究者在基因分子層面對菌株進行改造，采用基因工程的手段（基因克隆、敲除，轉錄和表達等）來構建基因工程菌，以提高其菌株的性能，進而提高γ-PGA的產量。Su等［35］首次將細菌血紅蛋白基因（vgb）采用同源重組方式整合入枯草芽孢桿菌染色體中，突變株枯草芽孢桿菌S18-3-vgb+能正常表達血紅蛋白基因，增強了攝氧能力，成功克服了發(fā)酵時黏度增加引起的溶氧不足，使菌體濃度提高1.26倍，γ-PGA產量增至60.5 g/L；Yeh等［36］研究組將一種高效合成表達控制序列（synthetic expression control sequence，SECS）單拷貝形式整合入非γ-PGA合成菌枯草芽孢桿菌DB430 yws C 基因上游，獲得重組菌枯草芽孢桿菌PGA 6-2，其在不添加額外谷氨酸和氯化銨的培養(yǎng)基中，能產生28 g/L的γ-PGA，在遺傳研究方面，是優(yōu)良的選擇性菌株。綜上所述，通過將外源基因或調控元件導入到γ-PGA菌株的基因組中，可使菌體濃度、攝氧能力或內源合成酶表達水平得到提高，以增加γ-PGA的產量。

4.2 發(fā)酵合成γ-PGA的培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件研究

4.2.1 碳源 對于用Bacillus 屬的幾種菌發(fā)酵合成γ-PGA最適碳源多為檸檬酸、甘油、果糖、淀粉、葡萄糖和麥芽糖等。其中不同菌株適用不同的碳源。Bacillus licheniform WBL-3［37］最適碳源為檸檬酸、甘油；Bacillus subtilis NX-2的最適碳源為淀粉和麥芽糖，但它不能利用檸檬酸作為碳源［38］；Bacillus licheniformis ATCC 9945a以最佳碳源為葡萄糖和甘油的組合［39］時，其γ-PGA的產量可達到 20.5 g/L，它也是合成γ-PGA的主要菌株之一。Yao等［40］運用13C核磁共振的方法跟蹤檢測13C標記的葡萄糖的結果表明，葡萄糖作為一種速效碳源，主要是作為菌體生長的營養(yǎng)物質，而添加的 L-谷氨酸則被用來合成γ-PGA，對于谷氨酸依賴型的菌株來說是來自外加的谷氨酸，對于非谷氨酸依賴型的菌株來說，其碳源通過內循環(huán)能提供合成所需的谷氨酸。大多數枯草芽孢桿菌以檸檬酸和葡萄糖作為最適宜的碳源，以供合成γ-PGA所需要的能量。就降低合成成本［41］考慮，宜用檸檬酸或葡萄糖作碳源。

4.2.2 氮源 對于Bacillus sp.而言，最適氮源包括有機氮源和無機氮源。無機氮源如氯化銨、硫酸銨、硝酸銨和尿素等，有機氮源包含豆?jié){、蛋白胨、酵母抽提物、玉米漿、玉米漿干粉、黃豆餅粉和花生餅粉等。無機氮源的組成比較清楚，但是營養(yǎng)成分比較單一；而無機氮源營養(yǎng)比較豐富，含有許多未知的促生長因子，能顯著促進菌體的生長，但是其組成成分不明確。不同的菌青睞不同的氮源。如以豆?jié){作為Bacillus licheniformis ATCC 9945a的氮源，γ-PGA的最高產量可以達到35 g/L［42］；以（NH4）2SO4等作為Bacillus subtilis IFO3335、Bacillus subtilis PGS-1的氮源，在發(fā)酵培養(yǎng)基中額外添加L-谷氨酸能促進γ-PGA的合成，且沒有副產物的產生［43］；用酵母抽提物代替硝酸銨，Bacillus licheniformis CGMCC3336的γ-PGA的產量比之前增加17%［44］。不同氮源對微生物的生長和目標產物的產量具有重要的影響，表現(xiàn)為氮源不僅可以通過同化作用轉變成微生物自身的組成成分，如重要功能性分子酶類和蛋白質等，而且也是某些目標產物合成的原料來源，如氨基酸類產物中的氮元素的主要來源。谷氨酸非依賴型菌株雖然γ-PGA產率較低，但由于可用廉價原料代替價格偏高的谷氨酸，因此在工業(yè)合成中有其實際應用意義。所以需要根據不同菌株合理選擇相適應的氮源。

4.2.3 金屬離子 某些金屬離子對Bacillus sbutilis 的γ-PGA合成非常重要，K+、Mn2+、Fe3+、Mg2+和Ca2+等金屬離子對枯草芽孢桿菌合成γ-PGA是必須的營養(yǎng)成分之一［45］。低濃度的Mn2+有利于枯草芽孢桿菌自身的生長，進一步提高培養(yǎng)基中Mn2+的濃度，枯草芽孢桿菌的生長反而被抑制，盡管如此，發(fā)酵液中γ-PGA的積累量仍然增加。同時Cromwick等［46］發(fā)現(xiàn)可以通過改變培養(yǎng)基中的Mn2+離子濃度來調節(jié)某些芽孢桿菌產物γ-PGA的多聚體鏈中D-型或L-型谷氨酸的比例。同樣，培養(yǎng)基中添加Ca2+有利于菌體內多肽的合成，其濃度對于菌體活性具有重要的影響作用。在發(fā)酵合成γ-PGA的過程中，Mg2+可能具有控制菌體內專一性很強的D-和L-多肽合成酶系統(tǒng)的作用。隨著枯草芽孢桿菌原生質體的獲得，金屬離子對γ-PGA發(fā)酵合成的影響作用將會得到進一步深入研究。因此，培養(yǎng)基中金屬離子種類和濃度對γ-PGA的合成具有重要的影響作用。在發(fā)酵合成γ-PGA的過程中有許多酶類參加反應，金屬離子對維持這些酶的活性中心構象和保持酶活性方面具有重要的作用。

4.2.4 其他培養(yǎng)條件 除了碳源、氮源、金屬離子對γ-PGA合成造成影響外，還有一些鹽類，如NaCl的加入，對其合成有一定的影響。有研究發(fā)現(xiàn)［32］，加入一定濃度的NaCl，可以減小發(fā)酵后期發(fā)酵液的黏度，起到消泡的作用。其原因是加入的NaCl破壞了γ-PGA形成的凝膠網絡結構，甚至使γ-PGA的黏彈性完全喪失，從而降低其黏度，但加入的NaCl量太高，會使發(fā)酵液中的滲透壓過高，會導致細胞脫水死亡，影響γ-PGA的產量；另外，培養(yǎng)條件對其γ-PGA合成也有影響，如轉速太低，傳質不均勻，溶氧不足；轉速太高，對菌體產生的剪力越大，會破壞菌體的細胞壁、細胞膜，不利于菌體的生長，進而影響產物的生成［44］，因此需要選擇合適的轉速；好氧微生物在生長過程中需要給菌體生長提供足夠的溶氧量，供氧量不足時，好氧微生物會在厭氧條件下，其正常的生理代謝會受到影響［47］；另外，有研究發(fā)現(xiàn)［46］，Bacillus licheniformis ATCC 9945a在pH維持在6.5時γ-PGA生成量最大，而pH小于5.5或大于7.4則γ-PGA生成量顯著下降。培養(yǎng)條件的研究對提高γ-PGA的產量具有重要作用，必須創(chuàng)造適合于菌體產γ-PGA的最佳環(huán)境，才能讓微生物發(fā)酵出更多的γ-PGA。

4.3 合成γ-PGA的發(fā)酵方式研究

發(fā)酵方式有多種，如液體發(fā)酵、固體發(fā)酵、固定化細胞發(fā)酵等。通過微生物的方式發(fā)酵合成γ-PGA，常用的發(fā)酵方式為液體發(fā)酵，Cromwick等［46］以Bacillus licheniformis ATCC 9945a菌株在適宜的條件下液體發(fā)酵γ-PGA，其產量可達到25 g/L。液體發(fā)酵的優(yōu)點是發(fā)酵過程中的參數容易控制，發(fā)酵周期短，有利于后期分離提取，成本低廉，適合工業(yè)化大生產。Chen等［48］采用固態(tài)發(fā)酵，其培養(yǎng)成分雞糞、豆餅粉、麥麩用量為1∶1∶0.2，0.5%谷氨酸，0.5%檸檬酸，含水量65%，通過Bacillus subtilis CCTCC202048固體發(fā)酵，可得到42 g/L的γ-PGA。另外，Xu等［49］采用一種新型的有氧植物纖維床生物反應器（APFB），對細胞進行固定化發(fā)酵，通過發(fā)酵動力學進行分析，固定化細胞發(fā)酵表現(xiàn)出更高效的γ-PGA產量，用這個APFB反應器進行分批補料發(fā)酵，γ-PGA的產量達到了71.21 g/L。固態(tài)發(fā)酵與液態(tài)發(fā)酵相比，其優(yōu)點是設備和技術較簡易，成本、能源消耗低，培養(yǎng)基原料價格低廉、廣泛易得。不足之處是工藝參數難以控制，發(fā)酵速度慢，周期長，后期分離純化困難，離工業(yè)化生產還有一定的距離；固定化細胞發(fā)酵，雖然其發(fā)酵γ-PGA的產量比較高，但由于其發(fā)酵設備及相關技術有較高的要求，生產成本高，目前還處于實驗室階段，不適合工業(yè)化大生產。

綜上所述，影響微生物產γ-PGA的原因，主要包括內因（菌株本身的特性）和外因（培養(yǎng)基成分及發(fā)酵方式）兩方面。針對內因，可以通過構建工程菌，從分子水平上來將菌種改造成合成所需要的高產γ-PGA的菌株；針對外因，可以通過統(tǒng)計學的方法（如PB設計，CCD設計、正交實驗、響應面分析等）來進行培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件的優(yōu)化，為微生物提供一個有利于產γ-PGA的環(huán)境，最大限度的使菌株產γ-PGA。另外，改變傳統(tǒng)液態(tài)發(fā)酵方式，改變發(fā)酵設備等，也能提高γ-PGA的產量。另外，為了能迎合工業(yè)化大生產的需要，不僅是要提高 γ-PGA的產量，而且還要能降低合成成本，合成可采用廉價的原料，如甘蔗、糖蜜［50］、玉米漿干粉、牛糞堆肥、合成味精的殘渣［51，52］等合成γ-PGA。本研究正在從廉價的培養(yǎng)基原料（如玉米漿干粉、糖蜜、黃豆餅粉、麥麩等）著手，其成分為天然的營養(yǎng)成分，營養(yǎng)豐富，價格低廉，適合作為工業(yè)化大生產的原料，通過統(tǒng)計學的方法，已篩選出最佳培養(yǎng)基配方，γ-PGA的產量可達到50 g/L。

5 展望

γ-PGA最吸引人的特性在于它是水溶性的、無毒、可生物降解、可食用等，這些特性使其有大量潛在的商業(yè)應用前景［53］，目前研究得比較熱門的菌株主要是地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniforms）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。而急需解決的是如何降低合成成本、提高PGA的產量、控制產物分子量等。根據國內外研究現(xiàn)狀，γ-PGA的未來研究方向可向這些方面來發(fā)展：尋求廉價的適合工業(yè)化大合成的原料，如玉米漿、黃豆餅粉等；篩選高效高產的優(yōu)良菌株，特別是谷氨酸非依賴型合成菌，并對發(fā)酵條件進行優(yōu)化；通過基因工程的手段，構建工程菌，提高菌株本身的合成性能，進而增加γ-PGA的產量。目前，在國外，如日本味之素株式會社利用納豆菌對谷氨酸進行聚合，成功的生成了PGA，已經投入到商業(yè)化生產當中；Cell Therapeutics公司開發(fā)出了以PGA作為藥物載體，用于治療腫瘤的藥物——PGA-紫杉醇藥物，其產品已經在日本、中國臺灣、韓國及亞洲其他國家和地區(qū)上市銷售。而國內的研究工作大部分僅限于實驗室，或者只有中小規(guī)模的生產，且偏重于菌種和發(fā)酵工藝，對菌株合成γ-PGA的基因層面、提取工藝研究相對較少。隨著研究的深入和基因改造手段的成熟，傳統(tǒng)方法對γ-PGA產量的提高越來越有限，而通過對基因和代謝流的改造，如提高關鍵酶的活性、增加正向調控蛋白的濃度、敲除γ-PGA的降解基因等，將會扮演越來越重要的角色。本研究組在分子層面，正在進行通過基因同源重組［54，55］的方法，通過氨芐青霉素作為篩選標記，敲除枯草芽孢桿菌中的降解酶基因［56］，減少γ-PGA產物的降解，進而提高γ-PGA的得率。

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（責任編輯 狄艷紅）

Progresses of Microbial Synthesis of Poly-γ-Glutamic Acid of Related Genes，Synthesis Mechanism and Fermentation

Yan Tao Xi Hongsheng
（Jingsu Hengfengqiang Bio-technology Co.，Ltd，Haimen 226100）

γ-polyglutamic acid（γ-PGA）is naturally occurring poly amino acids with characteristics of water solubility， biodegradability，edible and non-toxicity towards human， animals and the environment. Therefore， γ-Poly（glutamic acid）and its derivatives have been of interest in a broad range of industrial fields such as environment， medicine， food， cosmetics and feed additives. This paper focuses on the microbial synthesis of γ-PGA of related genes， synthesis mechanism and fermentation.

γ-polyglutamic acid；gene；mechanism；fermentation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.004

2014-08-09

嚴濤，男，碩士，研究方向：微生物發(fā)酵；E-mail：yantao2112@126.com