張禮林唐青藍(lán)許慶忠雷霆雯李紅梅

（1. 貴陽醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，貴陽 550004；2. 海南省第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，三亞 572000）

人FGF21原核表達(dá)載體的構(gòu)建及重組蛋白表達(dá)

張禮林1唐青藍(lán)2許慶忠1雷霆雯1李紅梅1

（1. 貴陽醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，貴陽 550004；2. 海南省第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，三亞 572000）

構(gòu)建人FGF21（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）cDNA的原核表達(dá)載體并誘導(dǎo)其重組蛋白表達(dá)。提取人肝臟總RNA后，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得目的片段，構(gòu)建其T載體進(jìn)行保存。再構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET-28a（+）-hFGF21，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株BL21（DE3）中，在IPTG誘導(dǎo)下得到可溶性表達(dá)，采用親和層析法純化表達(dá)產(chǎn)物后，進(jìn)行Western blot鑒定。成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28（+）-hFGF21，對其進(jìn)行可溶性表達(dá)后成功純化出his-hFGF21，經(jīng)Western blot鑒定該融合蛋白可與FGF21抗體特異性結(jié)合。成功構(gòu)建pET-28（+）-hFGF21，并可溶性表達(dá)his-hFGF21蛋白。

人成纖維細(xì)胞生長因子（FGF21）；克隆；原核表達(dá)；蛋白純化

成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）是一類由FGF基因家族成員編碼的結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其家族有23個成員，其中心區(qū)域都含有一段同源性為30%-70%的氨基酸序列［1］。龐大的FGF家族成員可調(diào)節(jié)生物代謝；調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移和分化；參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［2，3］。FGF21是FGF家族的一個新成員，是一種可分泌的蛋白［4］，近年來已經(jīng)成為國際上研究肥胖和糖尿病的熱點(diǎn)基因之一。FGF21可以降低血糖濃度，其對糖代謝的調(diào)節(jié)既不依賴于胰島素，又能夠增強(qiáng)胰島素的敏感性，促進(jìn)胰島β細(xì)胞的存活，還可以降低胰島素的使用濃度，改善胰島素抵抗［5-9］。同時(shí)，F(xiàn)GF21可以調(diào)節(jié)脂代謝，改善脂蛋白圖譜，降低血漿中低密度脂蛋白膽固醇，甘油三酯水平，并提高高密度脂蛋白膽固醇［10］。多項(xiàng)研究證明，糖尿病患者血清FGF21的表達(dá)量增高［11-13］，且FGF21水平增高是2型糖尿病獨(dú)立危險(xiǎn)因素［14］。此外，在肥胖個體中FGF21的血清水平上升［12］。 本研究擬構(gòu)建人FGF21的原核表達(dá)載體，并對其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和純化，以獲得人FGF21的融合蛋白，為后期進(jìn)一步研究FGF21的活性、作用及其與原發(fā)性高血壓相關(guān)性研究奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株 質(zhì)粒pMD-19-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司，受體菌E.coli DH5α菌株、E.coli BL21（DE3）菌株、pET-28a（+）質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 酶與主要生化試劑 總RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，Premix Taq、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ及BamHⅠ、T4 DNA Ligase、X-gal、IPTG、瓊脂糖凝膠DNA片段純化試劑盒、DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司，Trizol、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司，蛋白marker購自Fermentas MBI，超級感受態(tài)細(xì)菌制備試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，DMF、DMSO購自AMRESCO公司，過硫酸胺（APS）、疊氮化鈉、溶菌酶、甘氨酸、Triton X-100、咪唑、PMSF、考馬斯亮蘭R-250、TRIS、丙烯酰胺購自Solarbio公司，HIS-Select Nickel Affinity Gel 購自Sigma-aldrich公司、FGF-21 Antibody rabbit polyclonal IgG、Goat anti-rabbit IgG-HRP購 自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1 引物序列的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中人FGF21（NM_019113.2、GI：68215584）基因序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增人FGF21cDNA從235至777之間的共543個堿基的片段，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。H上游：CGGGATCCCACCCCATCCCTGACTCCAGT（下劃線為BamH I酶切位點(diǎn)，前兩個為保護(hù)性堿基），H下游：CCCTCGAGTCAGGAAGCGTAGCTGGGGCT（下劃線為Xho I酶切位點(diǎn)，前兩個為保護(hù)性堿基）。

1.2.2 RT-PCR 獲取目的片段與T載體構(gòu)建 試劑盒法提取人肝臟總RNA（人肝組織取自于貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科行肝臟切除術(shù)者。），經(jīng)M-MuLV酶合成人源型cDNA第一鏈，以cDNA第一鏈為模板，加入H上游、H下游引物各0.5 μL（10 μmol/L），Premix Taq 12.5 μL，加水至總體積25 μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入循環(huán)；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，循環(huán)30次；72℃延長10 min。擴(kuò)增出人FGF21 cDNA從235至777之間的共543個堿基的片段，構(gòu)建于pMD19-T載體，經(jīng)藍(lán)白斑篩選出陽性克隆子，對其進(jìn)行菌落PCR鑒定，并送上海生物工程公司測序，將測序正確的陽性克隆子命名為pMD19-T-hFGF21保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 人FGF21cDNA表達(dá)載體的構(gòu)建 以pMD19-T-hFGF21為模板，加入H上游（10 μmol/L）、H下游引物（10 μmol/L）各1 μL，Premix Taq 12.5 μL，加水至總體積25 μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入循環(huán)；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，循環(huán)30次；72℃延長10 min。大體系擴(kuò)增出目的片段，將PCR產(chǎn)物割膠回收后用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收酶切片段，并與用同樣兩種酶處理的pET-28a（+）質(zhì)粒進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，LK平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子，PCR鑒定后，挑單菌落接種培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定正確后送上海生物工程公司測序。

1.2.4 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Ecoli.BL21DE3感受態(tài)細(xì)胞，LK平板篩選陽性菌落，挑取單菌落，在LK液體培養(yǎng)基中37℃ 200 r/min過夜培養(yǎng)。按1∶500的比例取上述菌液轉(zhuǎn)接于LK液體培養(yǎng)基中，37℃ 200 r/min振搖，至 OD600達(dá)到0.4時(shí)，加入IPTG（終濃度為0.2 mmol/L），23℃120 r/min誘導(dǎo)4 h，收集菌體。將菌體蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳鑒定。

1.2.5 融合蛋白的純化 按上述條件誘導(dǎo)表達(dá)大量表達(dá)載體，收集菌體后，100 mL菌體沉淀中加入8 mL裂解液、60 μL PMSF（0.1 mol/L）吹打混勻，振蕩混勻20 min。冰浴超聲破碎1 h，4℃，12 000 r/min離心20 min，收集上清與沉淀，將上清與沉淀分別進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳鑒定。取超聲破碎上清，4℃ 12 000×g離心10 min后取100 μL裂解上清液與200 μL不含咪唑的平衡緩沖液，輕柔顛倒混勻數(shù)次。4℃ 5 000×g離心30 s，小心棄上清，并留樣少許保存。向凝膠中加入1 mL預(yù)冷的不含咪唑的清洗緩沖液清洗3次。輕柔混合親和凝膠30 s，4℃ 5 000×g離心30 s，小心棄上清，留樣少許，重復(fù)3次。最后，向凝膠中加入100 μL his洗脫緩沖液，輕柔旋轉(zhuǎn)混勻1 min，4℃ 5 000×g離心30 s，小心吸取上清，留樣保存，重復(fù)操作2次。將純化的蛋白液、留樣的漂洗液、洗脫液分別進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳鑒定。

1.2.6 Western blot鑒定 分別取BL21（DE3）菌株誘導(dǎo)表達(dá)蛋白裂解液、未純化的蛋白裂解液和純化his-hFGF21蛋白液經(jīng)SDS-PAGE凝膠泳后，將蛋白條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜上，經(jīng)Western blot封閉液封閉后，依次加入兔源性FGF21多克隆一抗，羊抗兔二抗，最后用ECL-Plus發(fā)光試劑顯色，干燥后掃描圖像保存。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 獲取目的片段與T載體構(gòu)建

2.1.1 RT-PCR 獲取目的片段 以人肝組織cDNA第一鏈為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增人FGF21 基因的完整開放閱讀框區(qū)，結(jié)果表明成功地從人FGF21 cDNA擴(kuò)增出目的片段。

2.1.2 T載體的構(gòu)建 通過T-A克隆將PCR產(chǎn)物與pMD-19T載體連接，將重組pMD-19T-hFGF21載體經(jīng)藍(lán)白斑篩選挑選出陽性菌落進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果見圖1，初步驗(yàn)證了所構(gòu)建T載體上帶有目的基因。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測人FGF21重組載體pMD19T-hFGF21菌落PCR

2.1.3 測序鑒定 將菌落PCR鑒定正確的陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)12 h后，取1 mL送基因公司進(jìn)行序列分析，經(jīng)測定表明pMD19T-hFGF21基因堿基序列與GenBank公布的人FGF21cDNA序列一致，即可確認(rèn)人FGF21基因成功克隆到pMD-19T載體，將正確的克隆命名為pMD19T-hFGF21。

2.2 人FGF21基因表達(dá)載體的構(gòu)建

2.2.1 人FGF21重組表達(dá)載體連接 大體系擴(kuò)增人FGF21目的片段后，對其與表達(dá)載體pET-28a（+）分別進(jìn)行雙酶切，分別回收雙酶切片段，進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LK平板篩選陽性菌落，結(jié)果見圖2，初步表明人FGF21重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖2 人FGF21重組表達(dá)載體Kan抗性篩選平板

2.2.2 人FGF21重組表達(dá)載體酶切鑒定 將LK平板篩選的陽性菌落接種于LK液體培養(yǎng)基中，37℃200 r/min培養(yǎng)14 h后提取質(zhì)粒，雙酶切處理，酶切結(jié)果見圖3，由此鑒定人FGF21重組表達(dá)載體構(gòu)建成功，將其命名為pET-28a（+）-hFGF21。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳檢測人FGF21重組表達(dá)載體酶切圖

2.2.3 測序鑒定 雙酶切鑒定正確的質(zhì)粒DNA定量后取30 μg送基因公司進(jìn)行序列分析，經(jīng)測定表明pET-28a（+）-hFGF21基因堿基序列與GenBank公布的人FGF21基因序列一致，即可確認(rèn)人FGF21基因成功克隆到pET-28a（+）表達(dá)載體上，將正確的克隆命名為pET-28a（+）-hFGF21。

2.3 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

取pET-28a（+）-hFGF21的BL21DE3陽性菌經(jīng)抗生素篩選后取單菌落接種于LK液體培養(yǎng)基中，37℃ 200 r/min振搖過夜，擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為0.4時(shí)，在IPTG終濃度為0.2 mmol/L、1 mmol/L的條件下，以23℃ 120 r/min振搖后4 h，收集菌體沉淀，用2×sample buffer變性處理，SDS-PAGE鑒定（圖4）發(fā)現(xiàn)在22 kD左右均出現(xiàn)明顯目的蛋白條帶。

圖4 SDS-PAGE電泳檢測hFGF21蛋白誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物

2.4 融合蛋白的純化

2.4.1 菌體破碎 取pET-28a（+）-hFGF21的BL-21DE3菌種抗生素平板接種過夜后，挑取單菌落于LK液體培養(yǎng)基中振搖過夜，按1∶500的比例取20 μL菌液加入100 mL新鮮抗生素液體培養(yǎng)基中，37℃ 200 r/min振搖至OD600達(dá)到0.4時(shí)，加入IPTG使其終濃度為0.2 mmol/L，23℃ 120 r/min振搖4 h，收集菌體沉淀加入8 mL裂解液、PMSF后振蕩混勻20 min，冰浴超聲破碎1 h，離心后分離上清與沉淀，變性后SDS-PAGE鑒定（圖5），由染色結(jié)果可知，his-hFGF21蛋白在上清液中大量表達(dá)。

圖5 SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白可溶性分析

2.4.2 FGF21蛋白純化 將裂解后的his-hFGF21蛋白裂解上清液與 his鎳親和凝膠結(jié)合后，將未結(jié)合的蛋白漂洗除去，再用 his洗脫緩沖液，將his融合蛋白從凝膠上洗脫下來，即得到純化的his-hFGF21融合蛋白。將洗脫液、漂洗液變性后進(jìn)行SDS-PAGE鑒定（圖6），均可見到明顯的目的蛋白，純化成功。

圖6 SDS-PAGE電泳檢測純化蛋白his-hFGF21

2.5 Western blot鑒定FGF21蛋白

一抗為兔抗FGF21多克隆抗體，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記鼠抗兔IgG，進(jìn)行Western blot免疫印跡分析，化學(xué)發(fā)光顯色后結(jié)果如圖7所示，hishFGF21蛋白與兔抗FGF21多克隆抗體呈陽性反應(yīng)，在約22 kD處有特異性蛋白反應(yīng)條帶。

圖7 Western blot鑒定his-hFGF21蛋白

3 討論

FGF21是由肝、胰、脂肪和骨骼肌、心臟、胸腺產(chǎn)生，可能從外周組織中以活化形式分泌［15-19］。FGF21 mRNA主要在肝臟中高水平表達(dá)［19］。本研究獲得了his-hFGF21融合蛋白，his-hFGF21的分子量約為22 kD，純化后的融合蛋白經(jīng)Western blot免疫印跡鑒定正確，說明關(guān)于his-hFGF21融合蛋白制備成功。

目前，關(guān)于FGF21的研究多集中在其糖尿病的相關(guān)性研究中，且將FGF21用于治療糖尿病已經(jīng)進(jìn)入2期臨床研究階段［20］，但尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于人FGF21與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性報(bào)道。本研究獲得了人FGF21的表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物his-hFGF21融合蛋白具有免疫原性，其活性還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了pET-28（+）-hFGF21，并可溶性表達(dá)出his-hFGF21蛋白。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Preparation of Prokaryotic Expression Construct of Human FGF21 cDNA and Its Recombinant Protein Expression

Zhang Lilin1Tang Qinglan2Xu Qingzhong1Lei Tingwen1Li Hongmei1
（1. Department of Biochemistry and Molecular Biology，Guiyang Medical College，Guiyang 550004；2. Department of Clinical Laboratory，the Third People's Hospital of Hainan Province，Sanya 572000）

Preparation of prokaryotic expression constructs of human FGF21（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）cDNA and induction of recombinant hFGF21 protein expression. Total RNA was extracted from human liver， and the target cDNA fragment was obtained using RTPCR. The amplified cDNA fragment was cloned into pMD19-T for preservation. Then the expression construct pET-28a（+）-hFGF21 was successfully constructed and expressed with IPTG induction， and the his-hFGF21 protein was purified with histide-selective nickel affinity gel and identified by Western blot. Western blot analysis showed that the fusion protein had specific binding with a FGF21 antibody.

human FGF21；molecular cloning；prokaryotic expression；protein purification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.032

2014-09-25

貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目資助課題（黔科合LG字［2011］012號）

張禮林，女，碩士研究生，研究方向：基因工程藥物；E-mail ： 2751628863@qq.com

雷霆雯，女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：基因工程藥物；E-mail：leitw@sina.com李紅梅，女，副教授，博士，研究方向：基因工程藥物；E-mail：gylhm@gmc.edu.cn