張曉立鄭小梅滿云羅虎于建東鄭平劉浩孫際賓

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.中國科學院系統微生物工程重點實驗室，天津 300308；3.中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所，天津 300308；4.中糧生物化學（安徽）股份有限公司，蚌埠 233010）

黑曲霉檸檬酸工業(yè)菌株原生質體制備與轉化

張曉立1，3鄭小梅2，3滿云4羅虎4于建東2，3鄭平2，3劉浩1孫際賓2，3

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.中國科學院系統微生物工程重點實驗室，天津 300308；3.中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所，天津 300308；4.中糧生物化學（安徽）股份有限公司，蚌埠 233010）

黑曲霉是檸檬酸工業(yè)化生產的主要發(fā)酵菌株。盡管現代遺傳操作技術在黑曲霉的實驗室菌株、蛋白質生產菌株等的應用中獲得了成功，但是檸檬酸工業(yè)菌株遺傳轉化異常困難，成為檸檬酸工業(yè)持續(xù)升級的重要限制因素。以檸檬酸工業(yè)生產實際應用的黑曲霉菌株為研究對象，對其原生質體的制備與再生以及PEG介導的轉化等條件進行了細致優(yōu)化。結果表明，檸檬酸高產工業(yè)菌株原生質體的制備需選取豐富培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h的年輕菌絲體，在1.5%裂解酶-0.5%蝸牛酶-0.2%溶菌酶的復合酶解體系下裂解2.5 h，原生質體的制備濃度可達106個/mL以上，原生質體再生效率可達90%以上。原生質體的濃度是原生質體-PEG介導轉化方法的關鍵，當原生質體濃度達到106個/mL以上時，高產檸檬酸菌株的轉化效率大幅提高。成功建立了由原生質體-PEG所介導的高產檸檬酸黑曲霉菌株的遺傳轉化體系。

黑曲霉；檸檬酸；遺傳操作系統；原生質體；DNA轉化

檸檬酸是生物體代謝活動中重要的中間產物［1］，也是在食品、醫(yī)藥、化工等領域應用最為廣泛的有機酸之一［2，3］。全球每年生產和消耗檸檬酸1.5×106t以上，黑曲霉是檸檬酸生產的主力菌種。但高產檸檬酸黑曲霉菌株由于經歷了長期的誘變篩選過程，細胞結構和遺傳可能發(fā)生了未知的變化，遺傳轉化困難。至今為止，黑曲霉高產檸檬酸工業(yè)菌株的分子遺傳操作尚無文獻報道。為提升檸檬酸工業(yè)生產的競爭力，急需建立黑曲霉工業(yè)菌株的遺傳轉化和操作體系。

黑曲霉常用的遺傳轉化方法與其他絲狀真菌一樣，包括孢子電轉化法［8］、農桿菌介導轉化法［9］、原生質體介導的轉化法等。Meyer 等［10］對這些轉化方法的利弊進行了系統的分析，認為孢子電轉化法操作簡單，但轉化效率低。農桿菌介導轉化雖具有轉化受體形式多樣、轉化效率較高、轉化子穩(wěn)定、可轉移大片段、單拷貝比例高等優(yōu)點，但其操作復雜，周期長，轉化過程受多種因素影響［9］。 Michielse等［11］也明確指出農桿菌介導轉化方法在黑曲霉中的轉化效率較低。原生質體介導的轉化方法包括原生質體電轉化法與原生質體-PEG介導的轉化法。姚婷婷等［12］在產酶的黑曲霉菌株中原生質體-PEG介導的轉化效率更高。原生質體-PEG介導的轉化方法也在不同野生型菌株或淀粉酶等黑曲霉生產菌株中得到成功實踐，如野生菌株A. niger NCIM565［13］與A. niger N402［14］、淀粉酶生產菌株A. niger CICIM F0410［12］與A. niger T21［15］等。由此可見，原生質體-PEG介導的轉化法對黑曲霉菌株而言是較為有效的遺傳操作方法。

本研究以高產檸檬酸的工業(yè)生產實際使用的黑曲霉菌株為研究對象，通過優(yōu)化培養(yǎng)基、培養(yǎng)方式、菌齡、酶解體系與酶解時間等研究其原生質體制備與再生的最佳條件，建立檸檬酸高產菌株原生質體-PEG介導的遺傳轉化體系，旨在為高產檸檬酸黑曲霉原生質體轉化及黑曲霉工業(yè)菌株改造奠定基礎。同時本研究對其他遺傳操作困難的絲狀真菌的分子改造具有一定借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質粒 檸檬酸工業(yè)生產使用的黑曲霉菌株：由中糧生物化學（安徽）股份有限公司提供，經過基因組測序分析鑒定，為由野生黑曲霉菌株Aspergillus niger D多輪誘變的A. niger Co827的衍生菌株。

用于遺傳轉化的質粒pGm：來源于文獻［16］，攜帶有amdS的篩選標記，由本實驗室保存。

1.1.2 工具酶和試劑 工具酶：α-淀粉酶（30 U/μL）購自諾維信（中國）生物技術有限公司；來源于木霉的細胞裂解酶購自Sigma；溶菌酶購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；蝸牛酶購自北京經科宏達生物技術有限公司。試劑：培養(yǎng)基配制及原生質體制備所需試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

（1）產孢培養(yǎng)基：黑曲霉專用固體培養(yǎng)基90 g/L；

（2）合成培養(yǎng)基Czapek-Dox（CD）：參照文獻［14］配置；

（3）豐富培養(yǎng)基（CMA）：葡萄糖20 g/L，麥芽糖浸提物20 g/L，蛋白胨1 g/L；

（4）檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)基（FC）：玉米粉200 g/L，α-淀粉酶（30 U/μL）300 μL/L，CaCl21 g/L；

（5）篩選培養(yǎng)基：上層培養(yǎng)基MMSA：乙酰胺0.59 g/L，CsCl 3.4 g/L，KCl 0.52 g/L，KH2PO41.52 g/L，山梨醇1.2 mol/L，微量元素1 mL/L，葡萄糖 10 g/L，MgSO40.5g/L，1%低熔點瓊脂糖；下層培養(yǎng)基MMS：成分與MMSA相同，1%瓊脂糖。

微量元素：FeSO4·7H2O 1 g/L，ZnSO4·7H2O 8.8 g/L，CuSO4·5H2O 0.4 g/L，MnSO4·H2O 0.1 g/L，Na2B4O7·10H2O 0.1 g/L，（NH4）6Mo7O24·4H2O 0.05 g/L。

（6）原生質體再生培養(yǎng)基：上層培養(yǎng)基MMSA+NaNO3：NaNO30.6 g/L，CsCl 3.4 g/L，KCl 0.52 g/L，KH2PO41.52 g/L，山梨醇1.2 mol/L，微量元素1 mL/L（如篩選培養(yǎng)基MMS所列，不再贅述），葡萄糖 10 g/L，MgSO40.5g/L，1%低熔點瓊脂糖。

下層培養(yǎng)基MMS+NaNO3：成分與MMSA+NaNO3相同，1%瓊脂糖。

1.2 方法

1.2.1 原生質體制備 檸檬酸工業(yè)生產菌株在產孢培養(yǎng)基上34℃培養(yǎng)6 d收集孢子并用含0.05%（V/V）Tween-80的生理鹽水［0.9%（W/V）NaCl］制備孢子懸液（107個/mL）。取適量的孢子懸液接種到200 mL豐富培養(yǎng)基CMA或合成培養(yǎng)基Czapek-Dox或檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)基FC中，孢子接種的終濃度為105個/mL，在旋轉式搖床34℃，250 r/min的條件下搖瓶液體振蕩培養(yǎng)不同時間。培養(yǎng)方式還采用液體靜止培養(yǎng)，或在液體搖瓶振蕩培養(yǎng)基中加入適量0.5 mm的玻璃珠。

采用八層紗布過濾收集菌絲球，然后用200 mL無菌蒸餾水清洗菌絲球，再用50 mL 溶液I（5 mmol/L K2HPO4、5 mmol/L KH2PO4、0.8 mol/L MgSO4，pH5.5）除去殘留的培養(yǎng)基，并使菌絲球處于溶液I的狀態(tài)下。將1 g菌絲球 加入到20 mL采用不同細胞裂解酶配比的細胞壁裂解液（以溶液I為基底緩沖液）中，在旋轉式搖床30℃，200 r/min的條件下分別對細胞壁進行不同時間的裂解處理。用3層無菌高級擦鏡紙過濾菌絲球裂解液收集原生質體，加入20 mL的溶液II（10 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L CaCl2、1.2 mol/L山梨醇，pH7.5）輕輕混勻后，3 000×g離心5 min，棄上清液，再用30 mL溶液II洗滌原生質體沉淀2次。最后將原生質體沉淀重懸于500 μL溶液II中，即為黑曲霉的原生質體懸液，可用于原生質體的再生與轉化。

1.2.2 原生質體再生 原生質體再生采用雙層平板法，首先在顯微鏡下用血球計數板對原生質體懸液進行計數，取100 μL原生質體懸液用溶液II進行適當稀釋。以MMS+NaNO3作底層培養(yǎng)基，以含1%低熔點瓊脂糖的MMSA+NaNO3與0.1 mL 原生質體稀釋液混合作上層培養(yǎng)基，置30℃ 培養(yǎng)3-4 d，對形成的菌落進行計數（A）。為消除由未除盡的菌絲片段再生出的菌落所造成的誤差，同時采用雙層平板法將原生質體置于未添加滲透壓穩(wěn)定劑MgSO4的MMS+NaNO3培養(yǎng)基，其再生菌落數作為對照（B）。顯微鏡下觀察的原生質體數計為（C）。再生率用下式計算：原生質體再生率=［（A-B）/C］×100%。

1.2.3 原生質體轉化 取100 μL原生質體懸液，加入10 μg的高純度質粒（質粒濃度應在1 μg/μL以上），再加入25 μL現用現配的溶液III（50%（W/V）PEG-4000、1 mmol/L CaCl2、10 mmol/L Tris-HCl，pH7.5），輕輕顛倒混勻，冰浴20 min，取出后緩緩加入1 mL 溶液III，2 mL 溶液II，輕輕顛倒混勻，將其與42℃孵育后以乙酰胺為唯一氮源的MMSA上層篩選培養(yǎng)基（1%低熔點瓊脂糖）混勻后，平鋪于下層MMS篩選培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)5-7 d。

2 結果

2.1 原生質體制備與再生

2.1.1 培養(yǎng)基對原生質體形成與再生的影響 在接種量與培養(yǎng)條件相同的條件下，將檸檬酸工業(yè)生產菌株在CMA培養(yǎng)基、FC培養(yǎng)基與CD培養(yǎng)基上培養(yǎng)，采用相同方法制備原生質體，考察培養(yǎng)基種類對原生質體形成和再生的影響。結果發(fā)現，CD培養(yǎng)基中菌絲球生長緩慢，培養(yǎng)48 h后菌絲長度僅有10-20 μm左右，總菌體生物量較低，難以進行原生質體的制備；在CMA培養(yǎng)基及FC培養(yǎng)基中，菌絲球生長迅速，菌絲細而長，培養(yǎng)48 h后菌絲長度可達80-120 μm左右，總菌體生物量較大；CMA培養(yǎng)基中菌絲球較密實，FC培養(yǎng)基中菌絲球較疏松（圖1）。使用FC培養(yǎng)基的情況下獲得的原生質體數量達5.5×106個/mL，再生率為74.5%；使用CMA培養(yǎng)基形成的原生質體數量為2.5×106個/mL，其再生率高達92%。結果表明，使用不同的培養(yǎng)基對菌絲球形態(tài)、原生質體的形成數量與再生率具有顯著影響。綜合考慮，CMA培養(yǎng)基為原生質體制備與再生的最佳培養(yǎng)基。

2.1.2 菌絲體培養(yǎng)方式對原生質體形成的影響 菌絲體培養(yǎng)方式影響黑曲霉菌球形態(tài)，分別考察了液體靜止培養(yǎng)、液體搖瓶培養(yǎng)、液體搖瓶加玻璃珠培養(yǎng)對原生質體形成的影響。結果發(fā)現，液體靜止培養(yǎng)時菌體漂浮在液體表面，菌體呈球狀聚集，菌體量較少；液體搖瓶加玻璃珠培養(yǎng)菌絲體呈球狀，菌絲斷裂，玻璃珠不僅沒有把較大的菌絲球分解，反而對菌體有一定的損傷，制備的原生質體數目與再生率較低，分別為0.28×106個/mL、82.1%；液體搖瓶培養(yǎng)菌絲體呈球狀，菌體量較大，菌絲細長，菌球相對疏松，原生質的數目為1.95×106個/mL，再生率較高為92.3%。因此，液體搖瓶培養(yǎng)是原生質體制備的最佳菌體培養(yǎng)方式。

2.1.3 菌齡對原生質體形成與再生的影響 為考察不同菌齡的菌絲球對原生質體制備與再生的影響，本試驗選取菌齡為36 h、48 h、60 h、72 h的菌絲球進行原生質體的制備。如圖2-A所示，不同生長時期的菌絲球對原生質體數量影響較大。菌齡為48 h的菌絲球酶解2.5 h獲得的原生質體數最高，達到6.5×106個/mL，而培養(yǎng)時間更短或更長的菌絲球獲得的原生質體數量都有幾倍的降低，表明適度培養(yǎng)時間的幼嫩菌絲的細胞壁更易被酶解釋放出原生質體。同樣原生質體的再生率在菌齡48 h時達到最高（圖2-B），為98%；隨著菌齡的增長，原生質體再生率沒有明顯變化，均超過90%。

圖1 檸檬酸工業(yè)生產黑曲霉菌株在不同培養(yǎng)基中菌絲球形態(tài)

圖2 培養(yǎng)時間-菌齡對原生質體制備（A）與再生（B）的影響

2.1.4 酶解體系與濃度對原生質體形成的影響 為研究檸檬酸工業(yè)生產黑曲霉菌株的最佳酶解體系，采用不同的酶解體系對CMA培養(yǎng)基液體搖瓶培養(yǎng)48 h的菌絲球進行原生質體的制備。結果（表1）表明，用不同配比的酶解液來酶解菌絲球均可獲得原生質體，但是效果不同。當裂解酶、蝸牛酶與溶菌酶以不同的方式組合時，其裂解效果均比裂解酶單酶裂解效果好。其中裂解酶的濃度是關鍵，1.5%（W/V）高濃度的裂解酶比1%（W/V）濃度的裂解酶裂解效果好?？傮w來看，1.5%裂解酶、0.5%蝸牛酶與0.2%溶菌酶的酶解體系原生質體的制備效果最好，達3.2×106個/mL。

表1 不同酶解體系對原生質體制備的影響

2.1.5 酶作用時間對原生質體形成與再生的影響 為研究檸檬酸工業(yè)生產黑曲霉菌株的最佳酶解時間，采用1.5%裂解酶、0.5%蝸牛酶、0.2%溶菌酶的酶解體系對CMA培養(yǎng)基液體搖瓶培養(yǎng) 48 h的菌絲球進行原生質體的制備與再生檢測。結果（圖3）表明，隨著酶解時間的延長，原生質體數逐漸增加，2.5 h 達到最高為1.84×106個/mL。同時2.5 h時原生質體的再生率也達到最高為96.7%。酶解時間超過2.5 h后，原生質體的制備效率與再生率出現明顯的下降。因此，高產檸檬酸生產菌株的原生質體制備與再生的最佳酶解時間為2.5 h，并且酶解后應盡快除去酶解液，以防止過度裂解，降低原生質體的制備與再生效率。

圖3 酶解時間對原生質體制備（A）與再生效率（B）的影響

2.1.6 原生質體轉化 采用PEG-4000-CaCl2介導的化學轉化法將帶有amdS篩選標記的質粒pGm轉化至檸檬酸工業(yè)生產黑曲霉菌株的原生質體中。結果表明，隨著原生質體數量的增加，轉化率也相應的增加，當原生質體數目達106個/mL時，轉化率為3-4個轉化子/μg DNA。

3 討論

近年來隨著傳統誘變技術對高產檸檬酸黑曲霉工業(yè)菌株的生產性能提升效果越來越有限，建立有效的遺傳操作系統，通過分子改造提升菌株生產性能引起了人們的重視。本研究從培養(yǎng)基、菌絲培養(yǎng)方式、菌齡、酶解體系與酶解時間等不同方面對高產檸檬酸黑曲霉菌株的原生質體-PEG介導的遺傳轉化方法進行了系統探索，建立了高產檸檬酸黑曲霉原生質體遺傳轉化體系。

菌球形態(tài)是影響高產檸檬酸黑曲霉菌株原生質體制備的一個重要因素。前期研究發(fā)現具有不同菌體形態(tài)的產檸檬酸的不同黑曲霉菌株，其原生質體制備的效果差異較大。例如，黑曲霉野生型菌株菌球疏松，菌絲細長，形成的原生質體數量多；相反檸檬酸高產菌株菌球密實，菌絲短粗，形成的原生質體數量較少，不易于原生質體的制備，這可能是由于菌絲體與酶解體系接觸表面積小造成的。

因此提出在保證一定菌體量的前提下，影響菌絲形態(tài)的因素，如培養(yǎng)基與培養(yǎng)方式，都會顯著影響原生質體的形成與再生。本研究發(fā)現，CMA與FC培養(yǎng)基盡管都能夠使菌體大量快速生長以保證原生質體制備所需的菌體量，但是培養(yǎng)的菌體形態(tài)存在較大不同。在FC培養(yǎng)基中菌絲細長，菌球疏松，獲得的原生質體數多，可達到5.5×106個/mL；而在CMA培養(yǎng)基中菌球較密實，形成的原生質體數量較少為2.5×106個/mL，該結果從原生質體制備的結果來看，菌絲細長，菌球疏松比較利于原生質體的制備，與朱萍等［17］報道一致。而合成培養(yǎng)基CD因為營養(yǎng)成分不足導致菌絲量較少，顯然不滿足原生質體制備需要。

液體靜置培養(yǎng)方式盡管因為供氧相對不足導致黑曲霉菌球相對松散，但由于生長過于緩慢，達不到原生質體制備所需的生長量，因而不適合；在液體搖瓶中加玻璃珠有助于菌體分散，然而我們發(fā)現玻璃珠將細長菌絲打斷，反而降低了原生質體制備與再生效率。在本試驗體系中液體搖瓶培養(yǎng)的效果更好。

本研究認為影響原生質體形成與再生的另一個主要因素是細胞壁結構與組成成分。其中一個表現是菌齡對原生質體的制備與再生影響顯著。我們發(fā)現處于對數生長期的培養(yǎng)48 h菌體的原生質體制備和再生效果最好，培養(yǎng)36 h的菌體在原生質體形成和再生方面都是最差的，而超過60 h的菌體盡管形成原生質體的數量低，但對再生效率影響小。這可能是由于不同生長階段的菌絲的細胞壁結構與組成成分不同［12］，對裂解酶系的敏感性不同，形成的原生質體數目及原生質體再生能力也就不同。過于幼嫩的菌絲雖然細胞壁容易被酶解，但是相對細胞膜也容易破裂，因而得到原生質體的產量低；即使能形成原生質體，但也可能由于細胞膜不夠完整或者細胞活力不強，導致細胞再生難度大。而菌齡過長的菌體細胞壁會沉積不宜被酶降解的物質，不利于原生質體的形成與釋放［18］，原生質體的形成數量減少，但其細胞結構可能相對完整且細胞活力強，因而對原生質體再生影響小。

有研究表明黑曲霉原生質體得率與酶解體系組成及配比關系密切。 Hamlyn等［19］就曾報道使用微生物產生的酶復合體或者商品酶的混合液制備原生質體比單獨使用一種酶的效果好。本試驗采用的混合酶系形成的原生質體數量是文獻報道［12］的2倍。各種酶的濃度配比和酶解時間需要根據特定菌株的細胞特性進行優(yōu)化，原則是既有利于原生質體的釋放，又不要過度酶解降低原生質體的穩(wěn)定性。原生質體的濃度和再生率對轉化率的影響較大［20，21］。周禮紅等［21］發(fā)現較高的轉化效率需要合適的原生質體濃度，本研究中高產檸檬酸黑曲霉菌株原生質體的濃度只有達到106個/mL以上，轉化效率才顯著提高，低于此濃度則難以獲得轉化子。由此可見，由于高產檸檬酸黑曲霉菌株經過復雜誘變，細胞壁組成與結構復雜，制備高濃度可再生的原生質體是能夠成功完成DNA轉化的關鍵。

4 結論

首次成功建立了以原生質體-PEG法介導的檸檬酸生產菌株黑曲霉的遺傳轉化體系。以豐富培養(yǎng)基（CMA）液體搖瓶培養(yǎng)48 h的菌絲體，采用1.5%裂解酶-0.5%蝸牛酶-0.2%溶菌酶的復合酶解體系酶解2.5 h后，可獲得高質量原生質體并可成功進行DNA轉化，為檸檬酸工業(yè)黑曲霉菌株的分子改造奠定堅實基礎。

［1］高年發(fā)， 張健， 高強， 等. 黑曲霉檸檬酸發(fā)酵機制研究的新進展［C］. 發(fā)酵有機酸科技交流， 2009：6-19.

［2］王玉堂， 劉緋. 我國斑點叉尾鮰產業(yè)發(fā)展現狀及對策［J］. 中國水產， 2007， 12：14-16.

［3］周進. 斑點叉尾鮰肌肉營養(yǎng)的分析［J］. 河北漁業(yè)， 2003， 1：17-19.

［4］ 郭艷梅， 鄭平， 孫際賓. 黑曲霉作為細胞工廠：知識準備與技術基礎［J］. 生物工程學報， 2010， 10；26（10）：1410-1418.

［5］ Weenink XO， Punt PJ， van den Hondel CA， Ram AFJ. A new method for screening and isolation of hypersecretion mutants in Aspergillus niger［J］. Appl Environ Microbiol， 2006， 69（6）：711-717.

［6］Fleissner A， Dersch P. Expression and export：recombinant protein production systems for Aspergillus［J］. Appl Microbiol Biotechnol，2010， 87（4）：1255-1270.

［7］Cherry JR， Fidantsef AL. Directed evolution of industrial enzymes：an update［J］. Curr Opin Biotechnol， 2003， 14（4）：438-443.

［8］Ozeki K， Kyoya F， Hizume K， et al. Transformation of intact Aspergillus niger by electroporation［J］. Biosci Biotechnol Biochem， 1994， 58（12）：2224-2227.

［9］ Meyer V. Genetic engineering of filamentous fungi -Progress，obstacles and future trends［J］. Biotechnology Advances， 2008，26：177-185.

［10］ Meyer V， Mueller D， Till S， et al. Comparison of different transformation methods for Aspergillus giganteus［J］. Curr Genet， 2003， 43（5）：371-377.

［11］ Michielse CB， Hooykaas PJ， van den Hondel CA， Ram AF. Agrobacterium-mediated transformation as a tool for functional genomics in fungi［J］. Curr Genet， 2005， 48：1-17.

［12］ 姚婷婷， 王正祥. 黑曲霉原生質體的制備、再生及轉化條件［J］. 食品與生物技術學報， 2006， 4（25）：116-120.

［13］ Ahuja M， Punekar NS. Phosphinothricin resistance in Aspergillus niger and its utility as a selectable transformation marker［J］. Fungal Genetics and Biology， 2008， 45：1103-1110.

［14］ Carvalho ND， Arentshorst M， Jin Kwon M. et al. Expanding the ku70 toolbox for filamentous fungi：establishment of complementationvectors and recipient strains for advanced gene analyses［J］. Microbiol Biotechnol， 2010， 87：1463-1473.

［15］ Liu L， Liu J， Qiu RX， et al. Improving heterologous gene expression in Aspergillus niger by introducing multiple copies of proteinbinding sequence containing CCAAT to the promoter［J］. Microbiology， 2003， 36， 358-361.

［16］ 孫晶， 李景鵬， 王敖全， 等. 黑曲霉pepB 基因缺失菌株的構建及其功能分析［J］. 微生物學報， 2004， 6（44）：766-770.

［17］ 朱萍， 梁海秋， 張弘， 等. 黑曲霉Ni-5k 原生質體的制備和再生［J］. 廣西農業(yè)生物科學， 2005， 4（24）， 339-342.

［18］ 王賡， 杜連祥. 新月彎孢霉原生質體制備及再生條件的研究［J］. 微生物學通報， 1999， 26（1）：21- 23.

［19］Hamlyn PF， Bradshaw RE， Mellon FM， et al. Efficient protoplast isolation from fungi using commercial enzymes［J］. Enzyme Microbial Tech， 1981， 3：321- 325.

［20］ 蘇彩云， 靳發(fā)彬， 張佳， 等. 絲狀真菌的DNA轉化方法［J］.河北化工， 2007， 7（30）：29-31.

［21］ 周禮紅， 王正祥， 諸葛健. 紅曲霉不同轉化方法的比較［J］.遺傳技術與方法， 2006， 28（4）：479-485.

（責任編輯 李楠）

Preparation of Protoplast for Efficient DNA Transformation of Citric Acid Hyper-producing Aspergillus niger Industrial Strain

Zhang Xiaoli1，3Zheng Xiaomei2，3Man Yun4Luo Hu4Yu Jiandong2，3Zheng Ping2，3Liu Hao1Sun Jibin2，3
（1. School of Biological Engineering，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457；2. Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308；3. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）；4. COFCO Biochemical（Anhui）Co.，Ltd.，Bengbu 233010）

Aspergillus niger is the major industrial strain for citric acid production. In spite of many successes of modern molecular biology approaches in engineering laboratory or protein-producing strains of A. niger， there is few positive report on its application for citric acid industrial strains mainly due to the hard-to-transform nature of these strains. In this study， the protoplast-PEG mediated genetic transformation system for citric acid industrial strain was extensively studied， suggesting an optimized protocol for protoplast preparation， regeneration and DNA transformation. The concentration of protoplasts reached up to 106/mL by lysing younger mycelia for 2.5 h after 48 h incubation of a proper amount of conidia spores in enrichment medium. The optimal lysing enzyme mixtures comprised of 1.5% lysing enzyme， 0.5% snail enzyme and 0.2% lysozyme. Concentration of protoplast influenced the protoplast-PEG mediated transformation efficiency， which reached the maximal when the concentration of protoplast was higher than 106/mL. The genetic transformation system established in this study should pave the way to molecular biology study of the citric acid hyper-producing strains， for further understanding its acid-tolerant physiology and for rational design of the industrial strain for further improvement of the citric acid production process as well as creation of new organic acid-producing cell factories.

Aspergillus niger；citric acid； genetic manipulation system；protoplast；DNA transformation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.025

2014-09-23

國家“863”計劃（2013AA020302），國家自然科學基金面上項目（31370113）

張曉立，女，碩士研究生，研究方向：輕工技術與工程；E-mail：xiaolizhang0607@sina.com；鄭小梅為本文并列第一作者，E-mail：zheng_xm@tib.cas.cn

孫際賓，男，研究員，博士生導師，研究方向：微生物代謝工程與系統生物技術；E-mail：sun_jb@tib.cas.cn