蔣卉，孟慶艷，蒲云峰，*

（1.塔里木大學南疆化工重點實驗室/生命科學學院，新疆阿拉爾843300；2.塔里木大學生命科學學院，新疆阿拉爾843300）

響應面法優(yōu)化蕪菁皂苷提取工藝的研究

蔣卉1，孟慶艷2，蒲云峰2，*

（1.塔里木大學南疆化工重點實驗室/生命科學學院，新疆阿拉爾843300；2.塔里木大學生命科學學院，新疆阿拉爾843300）

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以皂苷濃度為指標，應用響應面法中心組合試驗優(yōu)化蕪菁皂苷的提取條件。確定了蕪菁皂苷提取最佳條件為：提取溫度61.49℃，提取時間8.16 h，液料比10.50∶1.00（mL/g），甲醇濃度67.30%。在該條件下的理論值為（183.98±5.20）μg/mL與實測值（178.34±2.06）μg/mL無顯著差異（P＞0.05），說明回歸模型擬合程度較高，可用于蕪菁皂苷提取工藝的優(yōu)化。

蕪菁；皂苷；提取工藝；響應面法

新疆蕪菁學名Brassica campestris L．（syn.B.rapa. L．），是十字花科蕓薹屬蕓薹種下的蕪菁亞種，新疆維吾爾族對其俗稱恰瑪古［1］。蕪菁由于對環(huán)境的適應性強，產(chǎn)量高，在新疆干旱缺水的南部種植廣泛，深受當?shù)鼐S吾爾族等少數(shù)民族居民喜愛，并是有較長食用歷史的傳統(tǒng)蔬菜之一。同時，新疆蕪菁除含有大量營養(yǎng)素外，還含有揮發(fā)油、氨基酸、蛋白質(zhì)、糖及糖苷類、皂苷、鞣質(zhì)、酚類、有機酸、生物堿、黃酮、槲皮素等多種成分［2-3］，具有止咳、祛痰、平喘［4］、抗輻射、抗癌［5］、抗衰老、提高免疫力［6］、降血糖［7］等功能。

皂苷是天然植物中具有重要生物活性成分之一，據(jù)統(tǒng)計，有一半以上天然植物中含有皂苷［8］。目前，國內(nèi)外對于皂苷的研究報道較多，然而新疆蕪菁中皂苷的研究報道較少。并且國內(nèi)關(guān)于皂苷的提取多以乙醇為溶劑，而國外文獻多以甲醇為溶劑［9-10］。因此，本文以甲醇為溶劑，采用響應面法優(yōu)化蕪菁皂苷的提取工藝，為進一步研究新疆蕪菁皂苷及開發(fā)利用提供的理論參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

蕪菁：2013年11月購于阿克蘇農(nóng)貿(mào)市場，經(jīng)塔新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室焦培培副研究員鑒定為十字花科蕓薹屬蕓薹種下的蕪菁亞種Brassica campestris L．（syn.B.rapa.L．）植物。齊墩果酸、乙醚、甲醇、硫酸、香草醛、正丁醇等均為分析純試劑。

GZX-9240鼓風干燥烘箱：上海博訊實業(yè)有限公司；DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋：北京永光明醫(yī)療儀器廠；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHZD（III）循環(huán)水式真空泵：鞏義予華儀器有限責任公司；TU-1900紫外可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2方法

1.2.1原料預處理

新鮮蕪菁切成1 mm～2 mm薄片，在70℃的條件下烘干，然后研磨成粉，過80目篩，冰箱冷藏備用。

1.2.2蕪菁皂苷提取

準確稱取蕪菁粉4.0 g，以乙醚為溶劑，索氏抽提脫脂10 h，然后干燥去除溶劑，加入甲醇溶液，水浴回流浸提，然后抽提分離，收集濾液真空濃縮，再用蒸餾水定容至100 mL，取10 mL提取液用等體積水飽和正丁醇萃取2次，將2次萃取液混合并烘干，最后甲醇定容至50 mL，冷藏備用。

1.2.3皂苷含量測定

準確吸取皂苷溶液0.50 mL于25 mL試管中，加入8%香草醛乙醇溶液0.5 mL和77%硫酸5 mL，在70℃恒溫水浴15 min，然后冷水浴10 min，以試劑空白為參比，在波長545 nm下測定其吸光度及皂苷濃度。

1.2.4數(shù)據(jù)處理

單因素試驗結(jié)果方差分析采用軟件DPS7.55分析，響應面試驗回歸分析采用軟件Design Expert 8.0.6統(tǒng)計分析。

2結(jié)果與分析

2.1甲醇濃度對皂苷濃度的影響

參照1.2.2的方法，以不同濃度的甲醇提取新疆蕪菁皂苷，每個處理重復3次，其結(jié)果見圖1。

由圖1可以看出，甲醇濃度對皂苷濃度的影響十分顯著（P≤0.01），甲醇濃度越高，皂苷濃度越高，而當甲醇濃度超過60%時，隨著甲醇濃度增加，皂苷濃度變化不顯著（P≥0.05）。因此，從試驗結(jié)果來看，提取蕪菁皂苷的甲醇濃度以60%為宜。

2.2液料比對皂苷濃度的影響

參照1.2.2的方法，在液料不同的情況下，提取新疆蕪菁皂苷，每個處理重復3次，其結(jié)果見圖2。

圖1　甲醇濃度對皂苷濃度的影響Fig.1Effect of methanol concentration on saponins concentration

圖2　液料比對皂苷濃度的影響Fig.2Effect of ration of liquid to material on saponins concentration

由圖2可以看出，隨著液料比增加，皂苷濃度也顯著增加（P≤0.01），而當液料比超過9∶1（mL/g）以后，隨著液料比的增加，皂苷濃度的變化不顯著（P≥0.05）。因此，提取蕪菁皂苷的液料比以9∶1（mL/g）為宜。

2.3提取時間對皂苷濃度的影響

參照1.2.2的方法，分別提取2、4、6、8、10、12 h，測定其提取的新疆蕪菁皂苷濃度，每個處理重復3次，其結(jié)果見圖3。

圖3　提取時間對皂苷濃度的影響Fig.3Effect of extraction time on saponins concentration

由圖3可以看出，提取時間也對皂苷濃度存在顯著影響（P≤0.01），隨著提取時間增加，皂苷濃度也逐漸增大，而當提取時間超過8 h時，皂苷濃度增加緩慢，并且提取時間為8、10、12 h的皂苷濃度之間差異不顯著（P≥0.05）。因此，提取蕪菁皂苷的時間以8 h為宜。

2.4提取溫度對皂苷濃度的影響

參照1.2.2的方法，分別在30、40、50、60、70℃下提取新疆蕪菁皂苷，每個處理重復3次，其結(jié)果見圖4。

圖4　提取溫度對皂苷濃度的影響Fig.4Effect of extraction temperature on saponins concentration

由圖4可以看出，提取溫度對皂苷濃度也存在顯著差異（P≤0.01），隨著提取溫度升高，皂苷濃度也逐漸增大，而當提取溫度超過60℃后，皂苷濃度隨著溫度的增加反而降低（P≤0.05）。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是，溫度越高，分子運動越激烈，有利于皂苷的分離，然而甲醇的沸點為64.5℃，當水浴溫度為70℃時，提取液中部分甲醇以氣態(tài)形式存在，降低提取液中甲醇的有效濃度，導致皂苷濃度降低。因此，提取蕪菁皂苷的溫度以60℃為宜。

2.5響應面法優(yōu)化提取條件的試驗設(shè)計及結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇以提取溫度、提取時間、液料比、甲醇濃度進行響應面優(yōu)化試驗，采用Design Expert 8.0.6軟件輔助試驗設(shè)計，試驗設(shè)計及結(jié)果見表1。

表1　中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果Table 1The results of Central composite experimental design

續(xù)表1中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果Continue table 1The results of Central composite experimental design

運用Design Expert8.0.6對試驗結(jié)果多元回歸分析，方差分析結(jié)果見表2。

表2　回歸方程方差分析結(jié)果Table 2The results of variance analysis of regression model

由表2中的P值可知，在試驗范圍內(nèi)，C、D、D2對皂苷濃度影響達到極顯著（P＜0.01），另外A對皂苷濃度的影響也相對較大（P=0.087 1＜0.10）?；貧w系數(shù)R2＝0.823 8，對其F檢驗，其F=4.88＞F0.01（14，15）=3.66，說明回歸模型較好，其R2Adj=0.659 3，表明此模型能解釋65.93%效應值變化。同時對模型F檢驗，該模型達到極顯著（P=0.001 9＜0.01），失擬項P＝0.327 8＞0.05，表明模型的失擬度不顯著，該回歸模型預測值與實測值能較好的吻合。其擬合回歸方程為：

根據(jù)表2中F值判斷各因素對皂苷濃度影響的強弱，F(xiàn)值越大，影響作用越強。因此，各因素對皂苷濃度影響程度大小依次為甲醇濃度D＞液料比C＞提取溫度A＞提取時間B。

由Design Expert8.06軟件處理得到各因素交互作用的響應面圖見圖5。

圖5　各兩因素交互作用對皂苷提取濃度的影響Fig.5Response surface and contour plots for the interactive effects of four extraction parameters on saponins concentration

從圖5可以直觀地觀察各因素交互作用對皂苷濃度的影響，隨著甲醇濃度、液料比和提取時間增加，響應值先增加然后趨于穩(wěn)定；而隨著提取溫度升高，響應值先增加后減少。雖然試驗結(jié)果分析得出了響應面圖，但方差分析結(jié)果表明該模型中因素之間交互作用不顯著（P＞0.05）。

經(jīng)回歸分析得到的最佳提取條件為：提取溫度61.49℃、提取時間8.16 h、液料比（10.50∶1.00）mL/g、甲醇濃度67.30%，在該條件下，模型預測的皂苷濃度為（183.98±5.20）μg/mL，同時做了3次平行驗證試驗，獲得皂苷濃度為（178.34±2.06）μg/mL。對試驗值與預3結(jié)果與討論

測值進行t檢驗，t=1.88＜t0.05（3）=3.182，說明回歸模型擬合程度較高，可用于蕪菁皂苷提取工藝的優(yōu)化。

目前，國內(nèi)文獻多以乙醇（非極性：7.7；極性：4.3）為溶劑提取皂苷，而國外文獻多以甲醇（非極性：7.4；極性：6.0）為溶劑。甲醇與乙醇的漢森溶解參數(shù)較為接近，理論上均能提取皂苷。但從兩者的沸點（甲醇：64.5℃；乙醇：78.4℃）來看，以甲醇提取皂苷，后續(xù)濃縮操作更容易，這可能是國外研究者選擇甲醇的原因；然而乙醇具有低成本、低毒的優(yōu)點，或許這是國內(nèi)研究者選擇乙醇的原因。試驗結(jié)果也表明，無論是甲醇或乙醇為溶劑，均能較好地將皂苷分離出來。

通過響應面法優(yōu)化提取蕪菁皂苷的工藝，獲得了優(yōu)化工藝為：提取溫度61.49℃、提取時間8.16 h、液料比（10.50∶1.00）mL/g、甲醇濃度67.30%，在此條件下理論值為（183.98±5.20）μg/mL，與試驗值（178.34± 2.06）μg/mL差異不顯著，說明試驗的模型擬合程度較高，可用于蕪菁皂苷提取工藝的優(yōu)化。但是，試驗結(jié)果顯示，所選取的4個因素間不存在顯著交互作用，如果這種情況下選用正交試驗設(shè)計優(yōu)化，無論是選用L9（34）還是L16（45）正交表，試驗處理數(shù)至少減少一半，可大大提高了試驗效率。這也說明盡管響應面法具有許多優(yōu)點，廣泛地應用于各個領(lǐng)域，但它并不一定是最理想的優(yōu)化試驗設(shè)計。

近年來，已有一些文獻報道恰瑪古（新疆蕪菁）具有止咳、祛痰、平喘、抗輻射、抗癌、抗衰老、提高免疫力、降血糖等功能，對于蕪菁中皂苷是否與這些功能有關(guān)，或與哪些功能有關(guān)都還缺乏相關(guān)的研究。因此，對新疆蕪菁皂苷的分子結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)的研究，將是今后研究的重要內(nèi)容之一。

［1］劉勇民.維吾爾藥志（下）［M］.新疆：新疆科技衛(wèi)生出版社，1999：334-335

［2］周芳，海力茜·陶爾大洪，郁文.維藥恰麻古兒化學成分預實驗［J］.海峽藥學，2009，21（6）：100-102

［3］海力茜·陶爾大洪，馬桂芝，王菁，等.HPLC測定維藥恰瑪古兒藥材中槲皮素的含量［J］.中國現(xiàn)代應用藥學，2013，30（2）：169-171

［4］海力茜·陶爾大洪，周芳，楊珊，等.維藥恰麻古兒止咳、祛痰及平喘的藥效學研究［J］.中成藥，2011，33（4）：682-685

［5］肖春霞，張洪亮.恰瑪古膏影響中晚期大腸癌化療相關(guān)指標的臨床觀察［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2010，6（12）：30-32

［6］孫艷，安熙強.恰瑪古蜜膏對小鼠免疫功能的影響［J］.中國醫(yī)藥導報，2010，7（6）：20-23

［7］艾克拜爾江·阿巴斯，李冠，王靜.新疆蕪菁多糖降血糖作用的研究［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學，2011，48（3）：471-479

［8］S G Sparg，M E Light，J van Staden.Biological activities and distribution of plant saponins［J］.Journal of Ethnopharmacology，2004，94（2/3）：219-243

［9］Soetan k O l，Oyekunle M A.Evaluation of the antimicrobial activity of saponins extract of Sorghum Bicolor L.Moench［J］.African Journal of Biotechnology，2006，5（23）：2405-2407

［10］Chetna Acharya，Noor Afshan Khan.A triterpenoid saponin from the seeds of Ricinus communis and its antimicrobial activity［J］.Chemistry of Natural Compounds，2013，49（1）：54-57

Study on Optimum Extraction Process of Saponins from Brassica campestris L．（syn.B.rapa.L．）by Response Surface Methodology

JIANG Hui1，MENG Qing-yan2，PU Yun-feng2，*
（1.Key Laboratory of Chemical Engineering in South Xinjiang/College of Life Science，Tarim University，Alar 843300，Xinjiang，China；2.College of Life Science，Tarim University，Alar 843300，Xinjiang，China）

To optimize extraction process of saponins from Brassica campestris L．，the central composite experiment method was used to extract saponins based on the single-factor experiments.In combination with single factor test results，the results of optimum extraction condition was as follows：extracted temperature was 61.49℃，extraction time was 8.16 h，ratio of liquid to material was 10.50∶1.00 mL/g，and methanol concentration was 67.30%.There wasn't significant difference between the predicted value（183.98±5.20）μg/mL and the actual value（178.34±2.06）μg/mL（P＞0.05）.It showed clearly that the fitting degree of regression model was well.The optimized extraction process was economical，simple，reasonable and practicable.

Brassica campestris L．；Saponins；extraction technology；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.010

2014-07-11

新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室開放課題（BRYB1101）

蔣卉（1972—），女（漢），高級實驗師，本科，學士，研究方向：天然活性成分分離與分析。

蒲云峰（1981—），男（漢），講師，研究方向：食品科學與天然產(chǎn)物。