閆慶峰，李躍萍，閆佳

（1.海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，海南海口570102；2.海南醫(yī)學(xué)院，海南?？?71101）

木犀草素對大鼠心室肌細胞L型鈣電流的影響

閆慶峰1，李躍萍2，閆佳2

（1.海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，海南海口570102；2.海南醫(yī)學(xué)院，海南?？?71101）

研究木犀草素對大鼠心室肌細胞L型鈣電流的影響。分離單個大鼠心室肌細胞，應(yīng)用全細胞膜片鉗技術(shù)測定鈣電流。木犀草素能夠劑量依賴性地降低缺氧心肌細胞L型鈣電流：木犀草素小劑量組、中劑量組和大劑量組分別使Ica.L的峰值電流由給藥前的（921±51）pA減小到給藥后的（583.3±54）pA（P＜0.05）、（491.2±47）pA（P＜0.05）和（276.3±43）pA（P＜0.05），降低Ca2+電流幅值的百分率分別為36.7%、46.7%和70%，而在藥物被沖洗5 min后，L型鈣電流幾乎可恢復(fù)到正常水平。木犀草素能夠劑量依賴性降低缺氧心室肌細胞的L型鈣電流。

木犀草素；膜片鉗技術(shù)；鈣電流；心肌細胞

木犀草素（luteolin）是黃酮類化合物中的代表性成分，也是花生殼的主要藥用成分［1］。研究證實木犀草素具有清除氧自由基、降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、抗菌、抗病毒、抗癌、抗過敏和舒張冠脈血管等藥理活性［2-4］，其天然品在止咳、祛痰和消炎方面均有較好的療效。我們在既往的實驗研究中發(fā)現(xiàn)：木犀草素在離體心臟保存和心臟移植中具有較好的應(yīng)用前景，能顯著改善UW（University of Wisconsin solution）液對離體大鼠心臟的低溫保存效果（改善心臟的功能，抑制心肌細胞凋亡，減少心肌細胞氧化損傷［5-7］，但其作用機理不清，推測其心肌保護作用可能與鈣離子有關(guān)。因此本研究采用膜片鉗技術(shù)研究木犀草素對大鼠單個心室肌細胞膜上L型鈣電流（L-type Ca2+current，Ica.L）的影響，從而進一步解釋木犀草素的作用途徑。

1材料與方法

1.1對象和分組

健康成年SD大鼠，雌雄不限，體重（250±5）g，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心。分離SD大鼠心室肌細胞并隨機分為對照組（單純細胞記錄外液）及木犀草素小、中、大三個劑量組（細胞外液中木犀草素終濃度分別為7.5、15、30 μmol/L，這3種劑量的選擇依據(jù)藥理用量的原則，通過預(yù)實驗篩選得出），共記錄32個缺氧大鼠心室肌細胞，每組8個。

1.2藥品及試劑

木犀草素（純度＞99%），由杭州福斯特化學(xué)品有限公司提供；EGTA、膠原酶（typeⅡ）、HEPES由上海華美公司提供。Na2ATP、CsCl、CsOH、戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。臺氏液（Tyrode solution，mmol/L）：NaCl 143，CaCl21.8，KCl 5.4，MgCl20.5，NaH2PO40.3，HEPES 5，glucose 5，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4。無鈣臺氏液除了不含CaCl2外，其余成分與臺氏液相同。含酶無鈣臺氏液：無鈣臺式液40 mL加入30 mgⅡ型膠原酶。Krebs液（mmol/L）：L-glutamic acid 70，KCl 25，MgCl23，taurine 20，NaH2PO410，EGTA 0.5，HEPES 10，葡萄糖10，用KOH調(diào)節(jié)pH至7.4。含BSA的Krebs液：新鮮Krebs液40 mL加入40 mg BSA。不含葡萄糖的Krebs液除了不含葡萄糖外，其余成分與Krebs液相同。記錄L型鈣電流的細胞外液（mmol/L）：NaCl 135，CaCl21.8，CsCl 4.6，MgCl20.5，HEPES 5，葡萄糖10，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4。記錄L型鈣電流的電極內(nèi)液（mmol/L）：CsCl 140，MgCl20.5，Na2ATP 4，EGTA 1，HEPES 5，葡萄糖5.5，用CsOH調(diào)節(jié)pH至7.2。木犀草素溶液的配置：用細胞外液直接溶解木犀草素，制成終濃度為7.5、15、30 μmol/L的木犀草素溶液，以上液體均在使用前預(yù)充氧20 min～30 min。

1.3心室肌細胞分離

按文獻［8］采用酶解法制備心室肌單細胞并進行了改進，步驟如下：大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，游離心臟并浸入4℃的臺氏液中，行主動脈插管。然后在37℃下行主動脈逆行灌流心臟：先用無鈣臺氏液灌流3 min～5 min，然后用含Ⅱ型膠原酶的無鈣臺氏液40 mL循環(huán)灌流15 min～18 min。觀察心臟由膨大、張力增高至張力突然消失、松軟時用Krebs沖洗心臟2 min終止。用眼科剪沿房室溝處剪下心室部分，取左室游離壁，在Krebs液中剪碎心臟，用200目濾網(wǎng)過濾懸液，室溫靜置10 min沉降法分離心室肌細胞，棄上清，換入含BSA的Krebs液，靜置40 min后逐步復(fù)鈣至終濃度1.8 mmol/L，形成分離的鈣耐受心室肌細胞。室溫（18℃～25℃）靜置臺氏液1 h后，放于不含葡萄糖的Krebs液中，持續(xù)通入90%氮氣和10%氧氣的混合氣3 h后得到缺氧心室肌細胞。穩(wěn)定1 h后進行膜片鉗記錄鈣電流實驗。

1.4心室肌細胞L型鈣電流的測定

將一滴缺氧心室肌細胞懸液置于倒置顯微鏡載物平臺上的灌流槽中靜置5 min，待細胞貼壁后，以1.8 mL/min速度灌流細胞外液，在倒置顯微鏡下選擇長桿狀，邊緣折光性好，橫紋清楚，無收縮活動的心肌細胞進行實驗。記錄電極選用外徑1.4 mm硅硼有芯玻璃微電極毛坯，經(jīng)微電極拉制儀拉制而成（尖端為1μm～2 μm）。將微電極尖端拋光后沖灌電極內(nèi)液，調(diào)節(jié)三維微操縱器將電極緩慢浸入記錄外液，入液面前施以10 cm水柱左右的正壓，以防止液體中的雜物堵塞電極尖端。入液體后，測量電極阻抗，調(diào)零。在細胞記錄外液中的電極尖端電阻應(yīng)為2.5 MΩ～3.5 MΩ。選擇在細胞外液中已貼附于平皿底部的中等大小、大小相近的心室肌細胞，調(diào)節(jié)電極位置，使電極尖端逐漸接近細胞，接觸到細胞后，用注射器抽吸形成負壓并保持，通過負壓吸引作用形成1 GΩ～5 GΩ的巨歐封接，進行快電容補償，此時施以100 cm水柱左右的脈沖式負壓，負壓吸引力使電極尖端部分的膜片破裂，電極液與細胞內(nèi)液相通，而與細胞外液絕緣，此時可見膜電容電流出現(xiàn)，補償慢電容，形成全細胞記錄模式，全細胞記錄方式穩(wěn)定5 min后開始記錄心室肌細胞L型鈣電流和觀察藥物作用。心室肌細胞L型鈣電流設(shè)置：保持電位為-40 mV，指令電壓從-40 mV到+50 mV，階躍10 mV，間隔10s，時程為300 ms，頻率為0.5 Hz。觀察藥物作用時，電流記錄設(shè)置為：保持電位為-40 mV，鉗制電位為0 mV，時程為300 ms。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1缺氧大鼠心室肌細胞L型鈣通道電流的記錄

本實驗共記錄了8個大鼠缺氧心室肌細胞的內(nèi)向Ca2+電流。在電壓鉗模式下，得到缺氧心室肌細胞細胞Ca2+通道電流曲線，如圖1。

圖1　缺氧大鼠心室肌細胞L型鈣通道電流曲線Fig.1L-type calcium currents in hypoxia treated ventricular myocytes in rats

將實驗中記錄L型鈣通道電流的每一階躍命令的電壓值與其所對應(yīng)的Ca2+通道電流的最大幅值作圖，得到電流-電壓關(guān)系曲線，如圖2所示。

圖2　缺氧大鼠心室肌細胞L型鈣通道電流-電壓關(guān)系曲線Fig.2I-V relationship curve of L-type calcium currents in hypoxia treated ventricular myocytes in rats

從中可見從-40 mV開始激活的一系列內(nèi)向離子流，激活和失活過程均呈電壓和時間依賴性，其I-V曲線呈典型的倒置鐘型，鉗位電壓在-30 mV時鈣電流出現(xiàn)，峰值電位為0 mV左右。

2.2木犀草素對缺氧大鼠心室肌細胞L型鈣通道電流的影響

為了進一步探討木犀草素對缺氧大鼠心室肌細胞L型鈣通道電流的影響，本實驗以鉗制電位為0 mV時鈣電流為對照，在記錄外液中加入不同劑量的木犀草素（7.5、15、30 μmol/L），觀察各組L型鈣通道的電流曲線（n=8）。結(jié)果表明，灌流2 min內(nèi)，木犀草素可劑量依賴性地抑制L型鈣通道電流：小、中和大劑量木犀草素分別使Ica.L的峰值電流由給藥前的（921±51）pA減小到給藥后的（583.3±54）pA（P＜0.05）、（491.2± 47）pA（P＜0.05）和（276.3±43）pA（P＜0.05），降低的Ca2+電流幅值百分率分別為36.7%、46.7%和70%，并且在藥物被沖洗5 min后，L型鈣電流幾乎可恢復(fù)到正常水平，見圖3。

圖3　木犀草素對缺氧大鼠心室肌細胞L型鈣電流的作用Fig.3Effects of luteolin on L-type calcium currents in hypoxia treated ventricular myocytes in rats

另外我們觀察了木犀草素對Ica.LI-V曲線的影響，發(fā)現(xiàn)木犀草素可以降低各鉗制電位的電流幅度，但不改變ICa.L的激活電壓、峰值電壓等，因此不影響IV曲線形狀，見圖4和圖5。

圖4　木犀草素各劑量組對L型鈣電流的影響Fig.4The dose-related effects of luteolin on calcium currents

圖5　木犀草素各劑量組對電流-電壓（I-V）關(guān)系曲線的影響Fig.5The dose-related effects of luteolin on current-voltage（IV）relationship curve of L-type calcium currents

3討論

眾所周知，在心臟冷保存過程中，心肌的缺血和再灌注損傷是導(dǎo)致心肌組織損傷的重要原因。但因其機理十分復(fù)雜，現(xiàn)在尚未完全清楚，普遍認可的是氧自由基毒性學(xué)說和鈣離子超負荷學(xué)說，二者相互關(guān)聯(lián)，其共同結(jié)果是導(dǎo)致細胞膜性結(jié)構(gòu)破壞以及線粒體功能障礙，ATP生成和儲備減少，從而不能修復(fù)受損的組織細胞［9］。在生理情況下，經(jīng)L型鈣通道產(chǎn)生的內(nèi)向鈣電流是內(nèi)鈣釋放觸發(fā)的主要機制，同時在心臟缺血再灌注時，L型鈣通道產(chǎn)生的內(nèi)向鈣電流進一步加大，引起細胞內(nèi)鈣超載并導(dǎo)致細胞的死亡和凋亡［10］，所以L型鈣通道的激活對細胞內(nèi)的鈣濃度升高有著極其重要的意義。研究表明，鈣超載引起心肌細胞損傷的機理主要有以下幾個方面［11］：①大量Ca2+涌入細胞，觸發(fā)線粒體攝取Ca2+，使Ca2+主要聚集在線粒體內(nèi)抑制ATP合成，使能量生成障礙。同時Ca2+激活線粒體上磷脂酶，引起線粒體膜損傷，并在線粒體內(nèi)形成磷酸鈣沉淀，改變了線粒體膜的通透性，Ca2+外流，又使細胞由可逆損傷變?yōu)椴豢赡鎿p傷；②激活Ca2+依賴性磷脂酶（主要是磷脂酶C和磷脂酶A2），促進膜磷脂分解。在膜磷脂分解過程中產(chǎn)生的游離脂肪酸、前列腺素、白三烯、溶血磷脂等，均對細胞產(chǎn)生毒害作用；③激活鈣依賴蛋白酶，促使胞內(nèi)許多重要酶降解，同時也促進細胞骨架成分的降解，使胞內(nèi)無害的黃嘌呤脫氫酶加速轉(zhuǎn)變?yōu)辄S嘌呤氧化酶，使氧自由基的合成進一步增加；④激活鈣依賴性核酸內(nèi)切酶，引起DNA水解，阻斷了胞內(nèi)依靠轉(zhuǎn)錄而進行的潛在修復(fù)過程；⑤引起心肌持續(xù)痙攣，磷酸肌酸耗竭。

我們的前期研究已在langendorff心臟灌流模型上，觀察到木犀草素能顯著提高冷保存心臟的功能，減輕心肌的缺血和再灌注損傷。有文獻報道，木犀草素可能抑制平滑肌ROC和VDC，提示其可能具有預(yù)防心肌細胞鈣超載的作用［12］。本研究應(yīng)用全細胞膜片鉗技術(shù)，研究木犀草素對缺氧心室肌細胞膜上L型鈣通道的影響。結(jié)果表明，木犀草素可劑量依賴性抑制缺氧心室肌細胞L型鈣通道電流。因此，木犀草素可能通過抑制了L型鈣通道電流，減少流入胞內(nèi)的鈣離子，進而減少鈣庫內(nèi)鈣釋放，抑制心肌細胞內(nèi)鈣濃度升高，從而預(yù)防鈣超載。因此，木犀草素阻制Ca2+內(nèi)流的心肌保護作用可能是通過在缺血和再灌注早期有力阻制鈣離子快速大量進入細胞內(nèi)，減輕細胞內(nèi)鈣超載，從而改善冷保存心臟的功能。

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The Effect of Luteolin on L-type Calcium Current in Rat Ventricular Muscle Cells

YAN Qing-feng1，LI Yue-ping2，YAN Jia2
（1.Affiliated Hospital of Hainan Medical College，Haikou 570102，Hainan，China；2.Hainan Medical College，Haikou 571101，Hainan，China）

To explore the effect of luteolin on L-type calcium current in rat ventricular muscle cells.The single rat ventricular cell was seperated，and the technique of whole-cell patch clamp was apply to detect the calcium current.The results showed that luteolin dose dependently inhibited the L-type calcium current in hypoxia treated ventricular myocytes of the rats：in low dosage group，middle dosage group and high dosage group，the peak of Ica.Lrespectively reduced from（921±51）pA before treatment to（583.3±54）pA（P＜0.05），（491.2±47）pA（P＜0.05）and（276.3±43）pA（P＜0.05）after treatment，the value of electric current Ca2+that decrease in percentage was 36.7%，46.7%and 70%，respectively，and the electric current Ca2+could almost return to the normal level after luteolin was washout.Luteolin could dose-related inhibit the L-type calcium current in rat hypoxia treated ventricular myocytes.

luteolin；whole-cell patch clamp；calcium current；myocardial cells

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.14.002

2015-05-21

海南省自然科學(xué)基金資助項目（809042）；國家自然科學(xué)基金資助項目（81360029）

閆慶峰（1977—），男（漢），副教授，博士，研究方向：心肺保護。