劉清岱　劉素華　馬小倩等

摘要：采用粳稻遼粳294愈傷組織進(jìn)行分化誘導(dǎo)試驗(yàn)，研究碳納米管對粳稻愈傷組織分化和幼苗及根生長的影響。結(jié)果表明，添加濃度為10 μg/mL碳納米管的分化培養(yǎng)基，其粳稻愈傷組織出綠率為80%，成苗率達(dá)40%，明顯高于不加碳納米管的對照；當(dāng)碳納米管濃度為50 μg/mL時(shí)，成苗率及苗長較10 μg/mL處理時(shí)降低，但仍高于對照。說明一定濃度的碳納米管可以促進(jìn)粳稻愈傷組織分化及出苗和根系的生長。

關(guān)鍵詞：粳稻；碳納米管；愈傷組織分化；根系生長

中圖分類號(hào)：S512.2+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）19-4851-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.051

Absarct： The experiment of callus induction and differentiation of japonica rice Liaojing 294 was carried out to explore the effects of carbon nanotubes on japonica rice callus differentiation and seedling and root growth. The results showed that the callus differentiation and root growth were both promoted by carbon nanotubes at the concentration of 10 μg/mL， with the green rate and seedling emergence rate increasing to 80% and 40% respectively； and at the concentration of 50 μg/mL， the seedling emergence rate and seedlings length decreased compared with those at the concentration of 10 μg/mL， but were slightly higher than the control. It indicated that carbon nanotubes could promote the japonica rice callus germination and root growth at low concentration， while may have inhibition effects at high concentration.

Key words： japonica rice； carbon nanotubes； japonica rice callus differentiation； root growth

水稻（Oryza sativa L.）作為一種重要的糧食作物和模式生物，已被廣泛深入地研究，但是由于水稻自身的遺傳特性，其在組織培養(yǎng)過程中再生效率較低，極大地影響了水稻遺傳改良的進(jìn)程，并限制了對其自身生長發(fā)育過程及機(jī)理的研究[1]。水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究一直受到廣泛的關(guān)注，其遺傳轉(zhuǎn)化體系需要高效的外植體脫分化誘導(dǎo)和植株再生技術(shù)，自1965年中國開展水稻組織培養(yǎng)的研究以來[2]，用于水稻再生體系的外植體有成熟胚、幼穗、幼胚、花藥等[3]。與其他外植體相比，成熟胚具有取材不受生長季節(jié)限制、再生周期短、再生植株育性好、滅菌容易、外植體均勻、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，因此成熟胚的愈傷組織是一種較理想的適合于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的再分化體系[4，5]。

碳納米管是由碳原子組成的同軸納米管，直徑一般為1～20 nm，而長度在微米級(jí)。碳納米管具備良好的生物相容性，因此在生物科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用備受矚目[6，7]。2009年Khodakovskaya等[8]利用碳納米管促進(jìn)種子發(fā)芽和生長，并且率先提出了納米農(nóng)業(yè)的概念。當(dāng)前，納米科學(xué)與農(nóng)業(yè)科學(xué)不斷交叉與融合，催生了納米農(nóng)業(yè)科學(xué)等新興學(xué)科，為農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新提供了新的科學(xué)理論與方法。本試驗(yàn)以粳稻遼粳294成熟胚為材料，在分化培養(yǎng)基中加入碳納米管，研究碳納米管對粳稻愈傷組織分化的影響，探索優(yōu)化粳稻愈傷組織分化的新技術(shù)，旨在為實(shí)現(xiàn)高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

所用材料為粳稻遼粳294成熟胚，由天津天隆農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

單壁碳納米管規(guī)格：外徑<2 nm，長度30 μm，純度>95%，灰分<1.5%，比表面積>500 m2/g，電導(dǎo)率>100 s/m，購自中國科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 粳稻愈傷組織的誘導(dǎo) 選取飽滿的成熟粳稻種子，手工剝?nèi)シf殼，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，先用去離子水沖洗去表面塵土，然后用75%乙醇處理90 s，去離子水沖洗3遍，再用0.1%升汞處理15 min，最后再用去離子水沖洗3次，干燥之后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS+1 mg/mL 2，4-D+1 mg/mL KT）上，在24～26 ℃條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織形成。

1.2.2 配置碳納米管懸浮液 稱取10 mg的碳納米管于滅菌的1.5 mL離心管中，隨后加入去離子水990 μL。蓋好離心管蓋，置離心管于超聲波清洗機(jī)中100 W超聲2 h。最終的超聲時(shí)間隨懸浮狀態(tài)確定，一般應(yīng)至少保持納米材料均勻懸浮10 min以上。

1.2.3 粳稻愈傷組織的分化培養(yǎng) 配制10 mg/mL的碳納米管懸浮液并稀釋到不同濃度，然后在含有分化培養(yǎng)基（MS+1 mg/mL 6-BA+1 mg/mL NAA） 的培養(yǎng)瓶中加入不同濃度的（0、10、50 μg/mL）碳納米管懸浮液。待誘導(dǎo)培養(yǎng)基冷卻凝固后盡量挑選表面光滑、濕潤度高、顏色較白的愈傷組織接種于分化培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃、光照時(shí)間14 h/d、光照度1 500～2 000 lx。endprint

1.2.4 粳稻愈傷組織的繼代培養(yǎng) 在粳稻愈傷組織分化至30 d左右時(shí)，將沒有褐化的愈傷組織繼代到新的與原來濃度相同的分化培養(yǎng)基中。

1.2.5 觀察和結(jié)果的記錄 接種后對愈傷組織的分化情況進(jìn)行定期觀察，每5 d觀察一次，記錄愈傷組織的分化情況，15 d之后將分化出的幼苗定期取出進(jìn)行測量，并在30 d后對其根長進(jìn)行測量。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳納米管對粳稻愈傷組織分化的影響

遼粳294是遼寧省稻作研究所育成的優(yōu)質(zhì)水稻新品種，具有分蘗力強(qiáng)、抗倒伏性強(qiáng)、米質(zhì)優(yōu)良等特性。遼粳294接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上3 d后胚根開始萌發(fā)，4～5 d時(shí)開始長出1～2 mm黃色顆粒狀愈傷組織，之后粳稻愈傷組織增殖速度明顯加快，10 d時(shí)愈傷組織表面結(jié)構(gòu)比較緊密，表面平滑，呈現(xiàn)淡黃色。11～12 d時(shí)愈傷組織長至約3 cm后將其接種到分化培養(yǎng)基中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)粳稻愈傷組織在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d之后開始出現(xiàn)綠色生長點(diǎn)，各分化培養(yǎng)基中愈傷組織的出綠情況見表1。由表1可知，不加碳納米管的分化培養(yǎng)基愈傷組織的出綠率為60%，但含有碳納米管的分化培養(yǎng)基中愈傷組織的出綠率達(dá)80%，出綠率明顯高于對照，說明碳納米管對愈傷組織的分化有促進(jìn)作用。

隨著粳稻愈傷組織培養(yǎng)時(shí)間的增加，愈傷組織的出綠率不斷增大。觀察表明添加了不同濃度碳納米管的培養(yǎng)基中愈傷組織出現(xiàn)綠點(diǎn)的時(shí)間及個(gè)數(shù)各不相同，其結(jié)果見表2。由表2可知，不加碳納米管的分化培養(yǎng)基粳稻愈傷組織在6 d之后出現(xiàn)綠點(diǎn)，而添加了碳納米管的分化培養(yǎng)基愈傷組織在3 d后就開始形成綠點(diǎn)，加快了粳稻愈傷組織的分化過程，同時(shí)15 d后平均每5塊愈傷組織出現(xiàn)綠點(diǎn)總數(shù)為13～15個(gè)，而對照只有9個(gè)。但同一時(shí)間內(nèi)，碳納米管濃度為50 μg/mL的培養(yǎng)基中愈傷組織出現(xiàn)的綠點(diǎn)數(shù)較濃度為10 μg/mL的綠點(diǎn)數(shù)略少，說明可能由于碳納米管濃度升高，開始出現(xiàn)減緩愈傷組織分化的情況。

2.2 碳納米管對粳稻幼苗生長發(fā)育的影響

由表3可知，對照粳稻愈傷組織分化至15 d左右之后，綠點(diǎn)開始形成小苗，成苗率為25%，而添加了碳納米管的培養(yǎng)基中愈傷組織幼苗生長發(fā)育明顯加快，成苗率達(dá)38%～40%，可以看出添加了碳納米管的培養(yǎng)基平均每5塊愈傷組織的出苗數(shù)和成苗率都明顯高于對照組。

在粳稻愈傷組織分化至30 d左右時(shí)，由于原來培養(yǎng)瓶中的營養(yǎng)成分幾乎用盡需要進(jìn)行繼代，若不繼代容易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，時(shí)間過長會(huì)使已經(jīng)出現(xiàn)綠點(diǎn)的愈傷組織也不能繼續(xù)分化成苗。所以繼代時(shí)將出現(xiàn)綠點(diǎn)和綠苗的愈傷組織繼代到新的與原來培養(yǎng)基濃度相同的培養(yǎng)基上，已經(jīng)褐化的愈傷組織不進(jìn)行繼代。繼代后并繼續(xù)定期觀察，并記錄苗高，結(jié)果見表4。由表4可知，同一碳納米管濃度下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，幼苗平均高度增加；而在同一時(shí)間內(nèi)，碳納米管濃度為10 μg/mL的處理遼粳294幼苗生長狀況最好，其次是碳納米管濃度為50 μg/mL的處理。

2.3 碳納米管對粳稻根系生長的影響

粳稻的愈傷組織經(jīng)過30 d分化后，碳納米管濃度為10和50 μg/mL處理的粳稻幼苗根生長情況與不含碳納米管的對照相比，根系長勢良好。碳納米管濃度為10 μg/mL共培育的粳稻愈傷組織根長為2.05 cm，長勢最好，其次是碳納米管濃度為50 μg/mL的處理，根長為1.28 cm，而不含碳納米管的對照根長為1.05 cm，差異較明顯。

3 小結(jié)與討論

水稻愈傷組織的綠苗再生一直是遺傳轉(zhuǎn)化工作最關(guān)注的問題，許多水稻品種的轉(zhuǎn)化率很低，在很大程度上是由于分化率的影響，因此研究如何提高愈傷組織綠苗再生頻率是現(xiàn)在水稻工作者的研究重點(diǎn)[9]?，F(xiàn)在粳稻的組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)很成熟，愈傷組織誘導(dǎo)較容易，生長速度快，再生效率高，許多品種已經(jīng)建立了基于愈傷組織的重復(fù)性好、轉(zhuǎn)化率高的遺傳轉(zhuǎn)化體系[10]。

申聰香[11]的研究發(fā)現(xiàn)碳納米管能夠穿透完整植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞當(dāng)中以完成分子的傳送，而本試驗(yàn)結(jié)果同樣表明，碳納米管對粳稻愈傷組織具有生長調(diào)節(jié)作用，分化培養(yǎng)基中添加濃度為10～50 μg/mL碳納米管可促進(jìn)粳稻愈傷組織的分化和幼苗的生長，促進(jìn)根系生長。碳納米管濃度在10 μg/mL時(shí)對愈傷組織的促進(jìn)效果最好，其機(jī)理可能是碳納米管所具有的一些理化性質(zhì)使其能夠穿透粳稻愈傷組織，使愈傷組織內(nèi)部的大分子團(tuán)裂成小分子團(tuán)，在同一空間下，分子團(tuán)運(yùn)動(dòng)速度增加，提高了分子團(tuán)相互碰撞的幾率，從而使活性增強(qiáng)，并且碳納米管的存在導(dǎo)致水分吸收加強(qiáng)，使得愈傷組織有更高的發(fā)芽率和生物量，適當(dāng)濃度的碳納米管還可能調(diào)節(jié)植物內(nèi)部新陳代謝，增加抗逆性，促進(jìn)根系生長。但本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)碳納米管濃度為50 μg/mL時(shí)，粳稻的苗高和根長比碳納米管濃度為10 μg/mL處理時(shí)要短，說明碳納米管濃度過高可能對植物的生長產(chǎn)生副作用，但其機(jī)理尚需進(jìn)一步的探討。提高粳稻愈傷組織的增殖、分化及生根的具體機(jī)制目前還不清楚，有待于進(jìn)一步的研究。

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