錢永生　蔡蘇　吳劍丙等

摘要：通過對浙江省磐安地區(qū)“浙八味”藥材真菌病害進(jìn)行病原菌分離和鑒定，采用無菌培養(yǎng)基平板分離技術(shù)，從藥材植物病葉中分離獲得病原真菌，構(gòu)建真菌ITS系統(tǒng)發(fā)育樹，對病原菌進(jìn)行分子水平的分類鑒定，并觀察病原菌菌落形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)鑒定共獲得9種病原真菌，分別為鏈格孢菌（Alternaria sp.）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、球毛殼菌（Chaetomium globosum）、綠色木霉菌（Hypocrea virens）、月狀旋孢腔菌（Cochliobolus lunatus）、球孢黑孢霉（Nigrospora sphaerica）、木賊鐮刀菌（Fusarium equiseti）、束狀刺盤孢（Colletotrichum dematium）和莖點(diǎn)霉菌（Phoma sp.）。查閱藥用植物病原菌記錄并結(jié)合科赫法則實(shí)驗(yàn)，當(dāng)?shù)厮幱弥参锍蔀?種病原菌的新寄主，分別為月狀旋孢腔菌引起的安徽亳州白芍褐斑病、束狀刺盤孢引起的磐安闊葉麥冬炭疽病、球毛殼菌引起的早小洋菊葉枯病。

關(guān)鍵詞：“浙八味”； 中藥材； 病原真菌； ITS； 鑒定

中圖分類號：S432 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）19-4740-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.021

Abstract： The pathogen species and infection status in trueborn “Zhe-ba-wei” medicinal herbs were determined through investigation and identification of the pathogenic fungi in Panan region of Zhejiang province， should be provided the guide for protect medical herbs planting in large scale and eco-friend condition. Pathogenic fungi strains were separated from the infected leaves of medicinal herbs by plate separation in fertile medium. These pathogens were identified by construction of fungal ITS phylogenetic tree， and then analysis of colonial morphology and microstructure. 9 types of pathogenic fungi were finally obtained， namely Alternaria sp.， Fusarium oxysporum， Chaetomium globosum， Hypocrea virens， Cochliobolus lunatus， Nigrospora sphaerica， Fusarium equiseti， Colletotrichum dematium， Phoma sp. Compared with the related reports and Koch's postulates， the local medical herbs became new hosts for the three pathogenes. In these pathogens， Cochliobolus lunatus was the causative agent of brown spot diseases in White Paeony Root ‘An hui bozhou， Colletotrichum dematium induced anthracnose in Liriope platyphylla ‘Panan and Chaetomium globosum caused the leaf blight of Chrysanthemum‘Zao xiao yang ju.

Key words：“Zhe-ba-wei”； medicinal herbs； pathogenic fungi； ITS； identification

“浙八味”作為中國主要的出口中藥材，是浙江最具盛名的道地藥材，分別是杭白菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）、玄參（Figwort Root）、麥冬（Liriope platyphylla）、白芍（Paeonia lactiflora）、白術(shù)（Atractylodes macrocephala）、溫郁金（Curcuma wenyujin）、浙貝母（Fritillaria thunbergii Miq.）和延胡索（Corydalis yanhusuo）8種中藥材，近年來“浙八味”藥材的品質(zhì)和道地日益受到高度重視和關(guān)注[1]。

隨著“浙八味”種植數(shù)量的增加和規(guī)模的擴(kuò)大，各種嚴(yán)重的病害也相繼出現(xiàn)，如麥冬葉枯病、溫郁金枯萎病、玄參葉斑病、白絹病等[2-4]，正嚴(yán)重威脅“浙八味”藥材生產(chǎn)的安全和穩(wěn)定。傳統(tǒng)的病原菌分類方法主要根據(jù)菌株的形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)及生長特性來進(jìn)行，包括形態(tài)學(xué)分類、生態(tài)學(xué)特征分類、生理學(xué)和真菌的菌體組成分類分析等，由于大部分病原菌形態(tài)特征復(fù)雜，并且少數(shù)形態(tài)特征隨著環(huán)境的變化而變化，因此，傳統(tǒng)的菌物分類鑒定常引起不同意見[5]。浙江磐安是中國藥材之鄉(xiāng)，是“浙八味”主要種植地區(qū)，種植規(guī)模大，病害也特別嚴(yán)重，一般種植人員對“浙八味”藥材病原菌多采用傳統(tǒng)分類鑒定方法，但因形態(tài)、地域的差異，結(jié)論并不一致，有時出現(xiàn)治療效果欠佳，有時可能癥狀相似，在沒確定病原菌的情況下亂試殺菌劑，增加了病原菌的抗藥性和藥材農(nóng)藥殘留，對中藥品質(zhì)，經(jīng)濟(jì)效益和國際競爭力都會帶來負(fù)面影響[6]。因此，平常的形態(tài)鑒定有一定局限性。ITS-PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于真菌物種的分子鑒定以及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析[7，8]，本研究采用此技術(shù)并結(jié)合形態(tài)特征和光學(xué)顯微結(jié)構(gòu)觀察方法對磐安地區(qū)“浙八味”藥材病原菌進(jìn)行鑒定，以期為“浙八味”藥材病害進(jìn)行有效防治提供科學(xué)依據(jù)，這具有重要的生態(tài)學(xué)意義和經(jīng)濟(jì)價值[9]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2013年6月，對浙江磐安中藥材種植基地“浙八味”藥材病害情況進(jìn)行了調(diào)查，并收集感病葉片。所用供試材料為：紅花芍藥（Paeonia lactiflora）、早小洋菊（Chrysanthemum）、細(xì)葉白術(shù)、玄參（Figwort Root）、金菊（Chrysanthemum）2號、安徽亳州白芍（Paeonia lactiflora）、溫郁金、磐安闊葉麥冬（Liriope platyphylla）。

1.2 病原菌的分離與純化

取有病原菌部分的葉片，用無菌水沖洗4次，在無菌條件下晾干并用滅過菌的剪刀將有病原菌部分的葉片剪成1 cm×1 cm小塊，放在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，25 ℃恒溫黑暗倒置培養(yǎng)，經(jīng)過48 h發(fā)現(xiàn)不同癥狀的葉片上有明顯的菌絲產(chǎn)生，再把各種不同癥狀的菌絲從培養(yǎng)基邊緣挑取，并轉(zhuǎn)移至新PDA平板上，重復(fù)至獲得純培養(yǎng)物后，將PDA斜面置于4 ℃保存。

1.3 病原菌菌落形態(tài)與顯微觀察

把前期純化保存的菌種置于新鮮PDA平板培養(yǎng)，至病原菌生長到離平板邊緣約5 mm時，進(jìn)行外觀形態(tài)拍照記存；并在無菌條件下挑取部分菌絲置于干凈的載玻片上，用乳酸酚棉藍(lán)染色液浸染5 min，蓋上蓋玻片保存，在400×顯微鏡（Nikon 90i）下觀察拍照記存。

1.4 病原菌分子鑒定

1.4.1 DNA提取與rDNA間隔區(qū)序列的PCR擴(kuò)增 DNA提取參考曹夢潔等[10]試驗(yàn)方法進(jìn)行，利用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）與ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），擴(kuò)增病原菌rDNA ITS片段[11]，PCR反應(yīng)體系見表1。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸反應(yīng)45 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸反應(yīng)10 min，4 ℃保存。

1.4.2 ITS序列測定與數(shù)據(jù)分析 把經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后的PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物公司進(jìn)行雙向測序，獲得序列與Genbank中的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性比對[12]，試驗(yàn)所獲得的病原菌與序列同源性最高的真菌為同一屬，利用MEGA 5.10軟件進(jìn)行多序列匹配排列，對試驗(yàn)獲得病原菌序列與數(shù)據(jù)庫中登錄的近源菌株間的真菌一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌菌株分離結(jié)果與序列分析

“浙八味”藥材致病葉片通過PDA平板分離技術(shù)總共收集到20株病原菌樣品，通過ITS序列測定與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，對獲得高同源性的序列一起通過MEGA 5.10軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖1。

從圖1中可以看出，樣品中的F13Q-2、F13D-2與登入號（GU130297.1）中的菌同源性高達(dá)100%，根據(jù)rDNA ITS 區(qū)序列分析準(zhǔn)則[13]可初步確定該菌為肉座菌屬（Hypocrea）真菌。具有高度同源性的F13K-2、F13K-1b與登入號（JQ677042.1）中的菌聚為一支，為刺盤孢屬（Colletotrichum）真菌；F13I-2、F13Q-1與登入號（HM210092.1）中的菌聚為一支，F(xiàn)13E-1、F13F-2、F13P-2與登入號（AB425996.1）中的菌聚為一支，兩者同屬于鐮刀菌屬（Fusarium）；F13V-1b、F13V-1a與登入號（HQ631 000.1）中的菌聚為一小支，支持率為67%，再和F13V-3a與登入號（JQ388280.1）中的菌聚為一支，為莖點(diǎn)霉屬（Phoma）真菌；F13R-1、F13K-3、F13L-1、F13I-1、F13H-1與登入號（KC920885.1）中菌聚為一支，為鏈格孢屬（Alternaria）真菌；F13N-1b、F13U-1、F13A-2分別與登入號（JN689341.1、KC519729.1、DQ836800.1）中菌各聚一支，分別為毛殼屬（Chaetomium）真菌、黑孢霉屬（Nigrospora）真菌和旋孢腔菌屬（Cochliobolus）真菌。

試驗(yàn)獲得20株病原菌分屬于8個真菌屬。20株病原菌的來源、GenBank登入號、測序大小、病害特征等結(jié)果見表2。

2.2 病原菌菌落形態(tài)與顯微結(jié)構(gòu)

從PDA平板觀察20株病原菌，形態(tài)相似的歸為一類，總共可分為9類。并挑每類中外觀特征較好的一種菌進(jìn)行拍照和顯微觀察（全自動正置熒光DIC顯微鏡及成像系統(tǒng)），PDA平板菌落圖和顯微結(jié)構(gòu)特征見圖2和圖3。20株病原菌的原始菌落形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)特征描述見表3。

2.3 病原菌綜合鑒定

植物病原菌種類繁多，形態(tài)復(fù)雜，對這些病原菌僅從形態(tài)學(xué)來進(jìn)行鑒定，有一定的局限性[14]。基于ITS 序列的分子標(biāo)記技術(shù)鑒定具有簡便、快速等特點(diǎn)，對屬內(nèi)種間的分類鑒定具有一定的客觀合理性[15]。本研究通過ITS序列與形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)綜合觀察，并查閱文獻(xiàn)，綜合確定從磐安地區(qū)部分“浙八味”藥材中共分離獲得9種病原菌，分別為鏈格孢菌（Alternaria sp.）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、球毛殼菌（Chaetomium globosum）、綠色木霉菌（Hypocrea virens）、月狀旋孢腔菌（Cochliobolus lunatus）、球孢黑孢霉（Nigrospora sphaerica）、木賊鐮刀菌（Fusarium equiseti）、束狀刺盤孢（Colletotrichum dematium）和莖點(diǎn)霉菌（Phoma sp.）。

3 小結(jié)與討論

“浙八味”作為著名的藥用植物，有很多功能，芍藥的提取物因含單萜苷、芍藥苷和一些酚類化合物，可以治療關(guān)節(jié)炎、肝炎[16-18]。隨著種植規(guī)模的擴(kuò)大，近年來，藥用植物的真菌病害屢見報道，桑維鈞等[19]研究發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)葉點(diǎn)霉（Phyllosticta commonsii）、尖孢鐮刀菌可引起白術(shù)的葉斑病和枯萎病。陳小紅等[20]報道的玄參葉點(diǎn)霉（Phyllosticta scrophulariae）、炭疽菌（Colletot richum sp.）能引起玄參斑點(diǎn)病和芍藥炭疽病。羅有強(qiáng)等[2]曾報道膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）可引起山麥冬葉枯病。但隨著區(qū)域不同、季節(jié)變換，以及殺菌劑的使用，真菌病害也會有一定變化。目前，控制真菌病原體的主要方法是使用殺菌劑，但連續(xù)多年應(yīng)用相同殺菌劑，使得一些真菌已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性[21]，因此對某一藥材主產(chǎn)區(qū)病害情況進(jìn)行系統(tǒng)排查，確定突出的病原菌情況對當(dāng)?shù)氐乃幉纳a(chǎn)有很大的現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。然而由于傳統(tǒng)的病原菌形態(tài)學(xué)鑒定方法受主觀經(jīng)驗(yàn)與試驗(yàn)條件等影響而使鑒定工作有一定的局限性，單憑一種性狀是不可取的，只有互相驗(yàn)證，互為證據(jù)，才能更全面地對病原菌形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定。因此，在對病原菌鑒定分類時，綜合生理學(xué)性狀、生化性狀、形態(tài)學(xué)性狀和分子學(xué)性狀等信息是一種補(bǔ)充手段[22，23]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，以ITS序列分析為代表的分子生物學(xué)方法為病原菌鑒定帶來了希望，但rDNA-ITS序列分析也受到比對使用的基因庫完善程度的影響，在基因庫缺乏與待檢病原菌親緣關(guān)系相近的已知病原菌序列時或rDNA- ITS序列上表現(xiàn)為極小的差異性時，ITS序列分析就會受到一定的限制[23]。因此建議將ITS序列分析結(jié)果與傳統(tǒng)的病原菌形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果（包括顯微結(jié)構(gòu)和菌落形態(tài)等）相結(jié)合才能更準(zhǔn)確地對病原菌進(jìn)行鑒定，以防止偏面性。