劉迎春等

摘要：研究采用乳酸菌（Lactotacillus）、屎腸球菌（Enterococcus faecium）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和酵母菌（Saccharomyces），通過不同組合優(yōu)化豆粕固態(tài)發(fā)酵，在接種量相同、發(fā)酵時間不同的條件下，以未發(fā)酵豆粕為對照，測定各組的蛋白質(zhì)、脂肪、水分、灰分含量，選出最佳發(fā)酵方案。研究表明，不同組合的菌種及不同的發(fā)酵時間對發(fā)酵豆粕品質(zhì)的影響存在交互作用。不同菌種組合營養(yǎng)成分增加量不同，其中乳酸菌∶屎腸球菌∶枯草芽孢桿菌=1∶1∶1組增長最為明顯，隨著發(fā)酵時間的增加，其蛋白質(zhì)含量呈先上升后下降趨勢，在發(fā)酵第五天時達到最高點，顯著高于對照和其他組合，較0 d時提高了24.38%；灰分含量較低，較0 d時降低了8.89%，可作為豆粕發(fā)酵的適宜菌種組合。并利用HPLC同時測定未發(fā)酵豆粕和發(fā)酵最優(yōu)豆粕中水蘇糖和棉子糖含量。結(jié)果顯示，發(fā)酵最優(yōu)豆粕中水蘇糖和棉子糖含量顯著降低，可有效緩解動物食用后的消化不良、脹氣等問題。

關(guān)鍵詞：豆粕；混合菌發(fā)酵；水蘇糖；棉子糖；HPLC

中圖分類號：S816.42；TS214.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）16-4007-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.045

The Condition Optimization of Bacterial Combinations for Fermentation of Bean and Determination of the Content of Stachyose and Raffinose

LIU Ying-chun， CAO Yu， ZHANG Jian-xin， ZHANG Na， BI Lin-jie， LIU Tian， CHEN Jian-jun

（Life Science College， Henan Normal University，Xinxiang 453007，Henan，China）

Abstract： The bacterial combination for solid fermentation of bean pulp bran were optimized using lactobacillus ，Enterococcus faecalis，Bacillus subtilis，and saccharomycetes. The optimized fermentation combination was ascertained by the determination of the protein， moisture， ash， and fat contents in fermentated bean pulp.With the same inoculation quantity and different days，the unfermentated bean pulp was used as CK. The results showed that different combination of strains and different fermentation days had interaction effects on the quality of fermented bean pulp. Nutrients of fermented soybean meal by different combinations increased in different degrees compared to unfermented soybean meal. The increase of group B （lactobacillus： Enterococcus faecalis： Bacillus subtilis=1∶1∶1） was the most obvious. With the increase of fermentation time， the protein content went up and the went down.It reached the highest at day 5 of fermentation， which was signicantly higher than unfermented soybean meal and other combinations， increased by 25.45%. Ash content was lower and decreased by 9.89% than the unfermented bean pulp ，which can be regarded as the best combination of strains and fermentation time. High performance liquid chromatography was used to determine the content of stachyose and raffinose in unfermented bean pulp and fermented optimal. Strains of the optimal combination of stachyose and raffinose's content decreased significantly， which could effectively alleviate the digestion and flatulence of animals after eating it and improve the palatability of animals.

Key words：bean pulp； mixed strains fermentation； stachyose； raffinose； high performance liquid chromatography

中國是養(yǎng)殖大國之一，同時也是飼料原料特別是蛋白質(zhì)原料的需求大國[1]。近年來，隨著中國飼料工業(yè)的蓬勃發(fā)展，豆粕作為飼料工業(yè)中應(yīng)用最為廣泛的植物性蛋白質(zhì)原料的供應(yīng)量也在逐年增長[2]，由于其兼具賴氨酸含量高、貨源充足等優(yōu)點，成為目前畜牧養(yǎng)殖業(yè)使用量很大的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)源之一。然而，由于豆粕中抗營養(yǎng)因子的存在以及其適口性差等問題影響了豆粕的應(yīng)用價值[3]。大豆低聚糖（Oligosaccharides of soybeans，SBOS）是一類存在于大豆中的低分子糖，其主要成分是蔗糖（Sucrose）、水蘇糖（Stachyose）和棉子糖（Raffinose）。由于不能被胃和小腸中的消化酶消化，只能被結(jié)腸中的細菌發(fā)酵產(chǎn)生氣體，引發(fā)動物胃腸脹氣[4]，使其在動物體內(nèi)的消化率吸收率下降。

利用微生物發(fā)酵豆粕，成本低，對飼料營養(yǎng)成分的影響與破壞小，可以消除豆粕中胰蛋白酶抑制劑、低聚糖和植酸等的不利影響，有效緩解并消除動物食用后產(chǎn)生的消化不良、脹氣等問題，提高各類物質(zhì)的營養(yǎng)價值[5]，同時還可以積累有益的代謝產(chǎn)物和益生菌[6]。此外，豆粕為微生物生長提供了天然的碳源及氮源，經(jīng)過改造可配成適宜益生菌繁衍的培養(yǎng)基，將“廢棄物”變成優(yōu)質(zhì)飼料產(chǎn)品，是解決中國飼料蛋白質(zhì)不足的快捷、經(jīng)濟、有效的途徑，對于當前飼料行業(yè)緩解魚粉緊張的局面具有積極的意義。

本研究擬采用混合菌對豆粕進行發(fā)酵， 以降解豆粕中大分子蛋白質(zhì)和降低抗營養(yǎng)因子的含量，最終得到一種有利于動物消化吸收和生長發(fā)育等功效的豆粕發(fā)酵蛋白飼料。并利用HPLC同時測定未發(fā)酵豆粕和發(fā)酵豆粕中水蘇糖和棉子糖的含量，為發(fā)酵豆粕作為生物飼料的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆粕由焦作恒輝飼料廠提供；牛肉膏、蛋白胨、酵母浸出粉、葡萄糖、吐溫80、磷酸二氫鉀、三水乙酸鈉、檸檬酸三銨、七水硫酸鎂、一水硫酸鎂、氯化鈉、甘油磷酸鈉、溴甲酚紫、疊氮鈉、TTC等均由河南師范大學(xué)微生物實驗室提供；凱氏定氮所需試劑：硫酸鉀（分析純）、硫酸銅（分析純）、濃硫酸（98%）、硼酸（4%）、0.2 mol/L pH 7.4的磷酸緩沖液；三氯醋酸；10%三氯乙酸；混合指示劑（0.1%甲基紅乙醇溶液和 0.5%溴甲酚綠乙醇溶液按1∶1混合）；高效液相色譜所需試劑：水蘇糖、棉子糖標準品為Sigma公司色譜純產(chǎn)品；乙腈、95%乙醇、三蒸水均為色譜純；其他試劑均為分析純；0.45 μm有機濾膜。

1.2 儀器設(shè)備

分析天平（精度為0.000 1 g）；高溫電爐（可控溫在1 600 ℃）；高壓滅菌鍋；超凈工作臺；電熱恒溫培養(yǎng)箱（SGSP-020）；搖床；FOSS全自動凱氏定氮儀；量筒；容量瓶；燒杯；移液管；電子天平等；真空抽濾泵；高效液相色譜儀；色譜柱：氨基柱Agilent Zorbax carbohydratc （4.6 mm×150 mm，5 μm）；RID檢測器；電烘箱；干燥器；鋁盒；研缽或粉碎機等。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種及培養(yǎng)基制備 乳酸菌（Lactobacillus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、酵母菌（Saccharomyces）、屎腸球菌（Enterococcus faecium）均來自于河南師范大學(xué)微生物實驗室。

斜面培養(yǎng)：將酵母菌、屎腸球菌、乳酸菌和枯草芽孢桿菌進行斜面活化，其中酵母菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）活化，枯草芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨斜面進行活化，乳酸菌和屎腸球菌在MRS瓊脂培養(yǎng)基斜面活化，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

種子培養(yǎng)：挑取經(jīng)過活化的菌種，制成菌懸液，酵母菌在100 mL PDA液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)；枯草芽孢桿菌在50 mL牛肉膏蛋白胨中培養(yǎng)；乳酸菌和屎腸球菌在50 mL MRS液體培養(yǎng)基30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中擴大培養(yǎng)72 h。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取1 g硫酸銨、1 g尿素和1 g磷酸二氫鉀置于100 mL燒杯中，加入40 mL去離子水溶解后，加入盛有47 g豆粕的發(fā)酵培養(yǎng)皿中混合均勻，121 ℃下濕熱滅菌30 min。將不同種類的菌種接種到固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)96 h。

1.3.2 豆粕成分分析 粗蛋白質(zhì)含量測定：半微量凱氏定氮法（GB/T6432-2006）；灰分含量測定：550 ℃灼燒法（GB/T6438-2007/ISO 5984：2002）；粗脂肪含量測定：索氏抽提法（GB/T6433-2006）；水分含量測定：105 ℃恒重法（GB/T6435-2006）；水蘇糖、棉子糖含量測定：高效液相色譜法[7]

1.3.3 豆粕固態(tài)發(fā)酵 試驗設(shè)置3個試驗組，每組設(shè)置3個平行（表1），以未發(fā)酵為對照。根據(jù)表1的試驗安排，每試驗按照不同組合接種后，攪拌均勻，置于 30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在0、3、5、7 d取樣測定其蛋白質(zhì)、水分、灰分和脂肪含量，發(fā)酵時間共持續(xù)7 d。

1.3.4 蛋白質(zhì)的測定 凱氏定氮法[8]測蛋白質(zhì)含量。稱取5.0 g粉碎后的樣品，移入干燥的500 mL定氮瓶中，加入0.5 g硫酸銅、10 g硫酸鉀稍搖勻后，置于FOSS全自動凱氏定氮儀的消化器中進行消化，待溶液消化至澄清且藍綠色后自然冷卻；然后將冷卻后的定氮瓶移入FOSS全自動凱氏定氮儀的蒸餾器中，用盛有50 mL 4%的硼酸溶液和10滴混合指示劑的250 mL錐形瓶接收餾出物，收集約150 mL餾出物；最后用0.089 37 mol/L的鹽酸溶液滴定收集液，至溶液的顏色恰好從藍綠色變?yōu)榫萍t色為止。

空白試驗：約0.5 g蔗糖，按上述操作方法做空白試驗，消耗的 0.089 37 mol/L 的鹽酸溶液為0.2 mL。

結(jié)果按下式計算：

粗蛋白質(zhì)含量=■×100%

式中，C為鹽酸標準溶液的濃度，mol/L；V1為空白試驗滴定消耗的鹽酸標準溶液體積，mL；V2為樣品滴定消耗的鹽酸標準溶液體積，mL；m為樣品的質(zhì)量，g；0.014為氮的摩爾質(zhì)量，g/mmol；6.25為氮換算成粗蛋白質(zhì)的系數(shù)。

1.3.5 脂肪的測定 將盛有濾紙包的培養(yǎng)皿移入（105±2） ℃烘箱中干燥2 h，取出，冷卻，稱重（記作a），然后裝入3 g左右研細的樣品，封好，（105±2）℃干燥3 h，冷卻，稱重（記作b）。抽提，稱重：待乙醚揮發(fā)之后，將濾紙包置于（105±2） ℃烘箱中干燥2 h，放入干燥器冷卻至恒重為止（記作c）。

粗脂肪含量=（b-c）/（b-a）×100%

式中，a為稱量瓶加濾紙包重（g）；b為稱量瓶加濾紙包和烘干樣重（g）；c為稱量瓶加濾紙包和抽提后烘干殘渣重（g）。

1.3.6 水分的測定 稱取5.0 g樣品于已烘至恒重的鋁盒中，將鋁盒盒蓋套在盒底下，在電烘箱溫度升至105 ℃左右時放入樣品并烘3 h，取出試樣，立即蓋好盒蓋，放入干燥器內(nèi)，冷卻至室溫稱重，再復(fù)烘1 h，取出冷卻稱重，直至前后兩次質(zhì)量之差不超過0.005 g，即為恒重。如果后一次質(zhì)量高于前一次質(zhì)量，以前一次質(zhì)量為準。

計算公式如下：

X=■×100%

式中，X為試樣的水分含量，%；m1為干燥后試樣的質(zhì)量，g；m為試樣的質(zhì)量，g。

1.3.7 灰分的測定 稱取3.0 g試樣于已恒重的坩堝中，然后放在萬用電爐上，把坩堝蓋錯開約0.5 cm，加熱至試樣完全炭化至無煙為止。將炭化好的試樣送入高溫電阻爐口片刻，再移入爐中，錯開坩堝蓋，關(guān)閉爐門，在500～550 ℃的電爐內(nèi)灼燒2 h，灼燒中為使坩堝受熱均勻，可將坩堝調(diào)換2次，灼燒至黑點消失為止，取出坩堝，冷卻稱重，然后再復(fù)灼燒，取出坩堝冷卻稱重。直至前后兩次質(zhì)量相差不超過0.2 mg為恒重。

濕物質(zhì)的灰分按下式計算：

A1=■×100%

干物質(zhì)的灰分按下式計算：

A2=■×100%

式中，A1為試樣濕基灰分含量，%；A2為試樣干基灰分含量，%；X為試樣水分含量，%；m0為灰分質(zhì)量，g；m為試樣質(zhì)量，g。

1.4 水蘇糖、棉子糖的測定

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax carbohydratc柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為乙腈∶水（80∶20）；柱溫35 ℃；流速1.0 mL/min；進樣量為20.0 μL；示差折光檢測器[9]，檢測池溫度35 ℃。

1.4.2 標準溶液配制 分別稱取水蘇糖、棉子糖標準品（含量≥98%）各0.02 g置于5 mL容量瓶中，用去離子水溶解并稀釋至刻度，搖勻經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，濾液供HPLC分析用。

1.4.3 樣品制備 精確稱取5.00 g未發(fā)酵豆粕和發(fā)酵最優(yōu)豆粕樣品，粉碎后用石油醚回流除去脂肪，以料液比1∶9加入80%乙醇溶液，于60 ℃攪拌提取1 h，抽濾，濾渣用同樣方法提取2次，合并濾液。濾液用10%的醋酸鉛溶液沉淀蛋白，離心，重復(fù)2次至蛋白除盡，再用草酸除鉛至無鉛為止，濾液采用真空濃縮，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，供HPLC分析用。

1.4.4 測定方法 分別取水蘇糖、棉子糖標準溶液注入液相色譜儀，進行高效液相色譜分析，測定各組分色譜峰面積，以糖含量質(zhì)量對相應(yīng)的峰面積作標準曲線。在相同的色譜分析條件下，取20 μL試樣溶液注入高效液相色譜儀分析，測定各組分色譜峰面積，與標準曲線比較確定進樣液中水蘇糖、棉子糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆粕發(fā)酵后成分分析

2.1.1 發(fā)酵豆粕的蛋白質(zhì)含量 由表2可知，在發(fā)酵0 d時，各組蛋白質(zhì)含量相差不大；3 d時，各組蛋白質(zhì)含量均有所增加，B組蛋白質(zhì)含量最多，C組次之；5 d時，各組蛋白質(zhì)含量持續(xù)增加，B組蛋白質(zhì)含量仍然最多，A組次之，C組無明顯變化；7 d時，蛋白質(zhì)含量均有所下降，B組仍最高。由以上分析可知，當發(fā)酵到第五天時，B組菌種組合蛋白質(zhì)含量提高最多，較0 d時提高了24.38%。

2.1.2 發(fā)酵豆粕的脂肪含量 由表3可知，在發(fā)酵0 d時，對照組脂肪含量略高；3 d時，A組、C組脂肪含量均有所下降，B組脂肪含量增加較為明顯；5 d時，各組脂肪含量均有所增加，B組脂肪含量最高；7 d時，A組有所增加，B、C組變化不明顯，B組含量最高。由以上分析可知，當發(fā)酵至第五天時，B組菌種組合脂肪的含量最高。

2.1.3 發(fā)酵豆粕的水分含量 由表4可知，在發(fā)酵0 d時，C組水分含量明顯高于其他組；3、5 d時B組和對照組有所增加，C組略微下降，C組在第七天有所增加；B組在第0 d水分含量適中，第三天略微增加，第五天增加迅速，第七天略有下降。

2.1.4 發(fā)酵豆粕的灰分含量 由表5可知，在發(fā)酵0 d時，各組灰分含量相差不大；3 d時，各組灰分含量均有所下降，B組灰分含量最低，C組次之；5 d時，各組灰分含量持續(xù)下降，B組灰分含量仍然最低，A、C組次之；7 d時，各組灰分含量略微上升，排序為：B組

2.2 水蘇糖、棉子糖的測定

2.2.1 水蘇糖、棉子糖的標準曲線 由以上分析可知，B組（乳酸菌+屎腸球菌+枯草芽孢桿菌）發(fā)酵豆粕效果最好，利用HPLC同時測定未發(fā)酵豆粕和B組發(fā)酵豆粕水蘇糖和棉子糖含量。所得水蘇糖、棉子糖的標準曲線見圖1。圖1中，A為水蘇糖的直線回歸，方程為Y=264.010 74x+1 341.216 35，x為水蘇糖的含量；y為水蘇糖峰面積，R2=0.999 93；B為棉子糖的直線回歸，方程為Y=269.159 52x+

2 172.028 43；x為棉子糖的含量；y為棉子糖峰面積，R2=0.999 96。水蘇糖和棉子糖在1～10 mg/mL范圍內(nèi)線性均良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 93、0.999 96。大豆中抗營養(yǎng)因子是影響大豆蛋白源在飼料中使用的主要因素，主要成分為低聚糖（包括棉子糖和水蘇糖）。研究表明，當飼料中水蘇糖含量為1.0%時，試驗動物的生長受到顯著抑制，由于人或動物缺乏α-半乳糖苷酶，所以不能水解、吸收棉子糖和水蘇糖。它們進入大腸后，被腸道微生物發(fā)酵產(chǎn)氣，引起消化不良、腹脹、腸鳴等癥狀[10]使干物質(zhì)消化率顯著下降。采用混合菌發(fā)酵可產(chǎn)生水解酶、發(fā)酵酶和呼吸酶，使大豆抗營養(yǎng)因子失活、鈍化，消除了植物蛋白質(zhì)原料中的抗營養(yǎng)物質(zhì)，利于動物的消化吸收，有效提高了豆粕的利用率，增加了大豆蛋白質(zhì)在飼料中的使用量。

2.2.2 色譜分離 采用上述分析條件，柱溫選定為30 ℃，棉子糖和水蘇糖分離良好，兩者的保留時間分別為10.778、11.996 min（圖2）。利用HPLC同時測定未發(fā)酵豆粕和發(fā)酵最優(yōu)豆粕中水蘇糖和棉子糖含量（表6）。由表6可知，發(fā)酵最優(yōu)豆粕中水蘇糖和棉子糖含量顯著降低，B組水蘇糖含量較未發(fā)酵降低了59.04%，棉子糖降低了11.11%；發(fā)酵后的豆粕能有效消除抗營養(yǎng)因子的不利作用，提高豆粕質(zhì)量。

3 小結(jié)與討論

由3組混菌發(fā)酵結(jié)果可知，經(jīng)過微生物發(fā)酵后的豆粕營養(yǎng)成分都有不同程度的提高，其中B組（乳酸菌+屎腸球菌+枯草芽孢桿菌）發(fā)酵豆粕效果最好，B組蛋白質(zhì)含量較發(fā)酵之前提高最多，可達24.38%。豆粕經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后有酸甜芳香的氣味，pH下降，能有效改善其適口性，促進畜禽的食欲，同時可以降低抗生素、酸化劑的添加量，提供營養(yǎng)物質(zhì)，促進機體生長，還可提高礦物元素的生物活性，進而提高了豆粕的營養(yǎng)。屎腸球菌可把部分蛋白質(zhì)分解成酰胺和氨基酸，把大部分碳水化合物的無氮浸出物轉(zhuǎn)化為乳酸，使豆粕里的纖維變軟，并且在屎腸球菌的生理作用下通過催化、水解等反應(yīng)分泌出L-乳酸，它可以與鈣質(zhì)合成L-乳酸鈣，促進動物對鈣質(zhì)的吸收?？莶菅挎邨U菌是好氧菌，繁殖過程中產(chǎn)酸、酶和多種維生素，其中很多是動物本身不具有的酶，如降解豆粕中復(fù)雜糖類果膠酶、葡聚糖酶和纖維素酶等[11]。在初始培養(yǎng)條件下，枯草芽孢桿菌迅速生長，為之后厭氧菌乳酸菌提供良好的生長環(huán)境，3種菌種產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物發(fā)生互補效應(yīng)，產(chǎn)生了更豐富的酶系，利于微生物的增長，從而使可利用的蛋白質(zhì)含量有較高的增長。

混菌發(fā)酵豆粕可降低水蘇糖、棉子糖含量，水蘇糖含量較未發(fā)酵降低了59.04%，棉子糖含量降低了11.11%。微生物是良好的單細胞蛋白質(zhì)來源，可提高飼料中的蛋白質(zhì)含量，采用獨特的菌種和發(fā)酵工藝，利用菌種間交互作用，使豆粕本身的蛋白質(zhì)含量進一步提高。飼料原料的營養(yǎng)價值不僅取決于營養(yǎng)成分的高低，而且取決于動物對營養(yǎng)成分的吸收和利用能力。利用微生物混合菌種發(fā)酵豆粕，微生物可以有效地利用豆粕中不易被動物消化吸收的水蘇糖、棉子糖等抗營養(yǎng)因子來進行生長、繁殖，從而降低豆粕中的抗營養(yǎng)成分，提高了動物食用后的吸收利用率，打破了豆粕在飼料等領(lǐng)域應(yīng)用的局限性，提高了豆粕的經(jīng)濟價值。目前，大豆低聚糖的檢測方法主要有高效液相色譜法和高效氣相色譜法，這兩種方法都具有既可定性又可定量的優(yōu)點。其中高效氣相色譜法測定大豆低聚糖，使用的溶劑毒性較大，還需進行衍生化處理，且易造成溶劑拖尾，操作繁瑣。高效液相色譜法測定大豆低聚糖采用常規(guī)溶劑，樣品處理簡單，分離效果好，準確可行，重現(xiàn)性及回收率均比GC法好[12]。

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