吳盼盼，段元鋒，徐德平

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122）

油菜蜂花粉多糖的分離鑒定及免疫活性研究

吳盼盼，段元鋒，徐德平*

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122）

油菜蜂花粉粉碎后經(jīng)體積分?jǐn)?shù)95%乙醇脫脂，過(guò)濾，濾渣用去離子水60℃提取，再用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇沉淀提取液，得到油菜蜂花粉水提醇沉物。利用DEAE-纖維素柱、HW-55F色譜柱及Sephacryl色譜柱、Sepharose色譜柱對(duì)油菜蜂花粉水提醇沉物進(jìn)行分離，得到一個(gè)主要的多糖類(lèi)化合物。經(jīng)Sephadex G-100色譜柱及紫外光譜分析對(duì)該化合物進(jìn)行純度鑒定，再通過(guò)核磁方法對(duì)其進(jìn)行1H-NMR、13C-NMR和135DEPT-NMR分析，得該化合物結(jié)構(gòu)為HOCH2-［CHOH］4-COOH。給免疫抑制小鼠灌胃花粉多糖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：油菜蜂花粉多糖能顯著提高免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)（P＜0.01）、脾臟指數(shù)（P＜0.01）及血清IgG水平（P＜0.01）。

油菜蜂花粉水提物；免疫活性；分離；多糖

油菜（Brassica campestris L.）是十字花科蕓薹屬植物，為中國(guó)大面積種植的經(jīng)濟(jì)作物。油菜蜂花粉是蜜蜂采集油菜的花粉，再經(jīng)蜜蜂加工而成的花粉團(tuán)狀物，蜜蜂在采集花粉的過(guò)程中加入了一些花蜜和分泌物。油菜蜂花粉中含有蛋白質(zhì)和游離氨基酸、糖類(lèi)、脂類(lèi)、維生素、微量元素、酶、激素等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［1］，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。油菜蜂花粉具有增強(qiáng)免疫力、預(yù)防衰老、防治心腦血管疾病以及調(diào)節(jié)腸胃功能等作用［1-2］。

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［3-9］，油菜蜂花粉中具有增強(qiáng)免疫力作用的成分存在于蜂花粉水提物中，多數(shù)文獻(xiàn)認(rèn)為其中能夠提升免疫活性的物質(zhì)基礎(chǔ)為多糖。對(duì)于蜂花粉中多糖成分具有增強(qiáng)免疫活性作用的研究也一般以多糖粗品為主，對(duì)蜂花粉多糖成分結(jié)構(gòu)的深入研究甚少。對(duì)于花粉水提物中其它活性成分是否具有提高免疫力的功效并未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。作者針對(duì)這一問(wèn)題對(duì)油菜蜂花粉水提物中具有的免疫活性成分進(jìn)行了深入研究。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

油菜蜂花粉：購(gòu)于青海門(mén)源蜂場(chǎng)；昆明小鼠30只，雌雄各半，4周齡，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；注射用環(huán)磷酰胺（Cytoxan，CTX）：山西普德藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號(hào)04110606；羊抗小鼠抗血清：上海晶天生物科技有限公司產(chǎn)品；瓊脂：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；疊氮鈉：北京鑫鼎鵬飛科技有限公司產(chǎn)品；ODS柱填料：Nacalai Tosoh Inc產(chǎn)品；AB-8型大孔吸附樹(shù)脂：天津南開(kāi)大學(xué)化學(xué)工廠(chǎng)產(chǎn)品；GF254硅膠板：山東煙臺(tái)芝罘化工廠(chǎng)產(chǎn)品；其它試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2儀器和設(shè)備

DFY-600搖擺式高速中藥粉碎機(jī)：溫嶺市林大機(jī)械有限公司產(chǎn)品；CQ-005型萃取罐：常州市特威電氣自動(dòng)化系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；R-1002型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申順生物科技有限公司產(chǎn)品；核磁共振儀Avance 500 MHz：Bruker公司產(chǎn)品；ZF-90型暗箱式紫外透射儀：上海顧村電光儀器廠(chǎng)產(chǎn)品；CR3i高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1油菜蜂花粉水提醇沉物的制備

將10 kg油菜蜂花粉粉碎，過(guò)80目篩，投入100 L萃取罐，按料液質(zhì)量體積比比1 g∶8 mL加入體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇，60℃條件下攪拌提取3 h，抽濾得上清液與濾渣。濾渣回入100 L萃取罐中，按料液1 g∶5 mL比加入去離子水，60℃條件下提取3 h，抽濾得上清液和濾渣，濾渣按相同條件再提取一次，抽濾，合并兩次的上清液。將上清液濃縮到10 L，按體積比1∶4邊攪拌邊加入體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇，室溫下沉淀12 h。將上清液與沉淀分離，沉淀用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇洗滌兩次，真空干燥后即為水提醇沉物。

2.2油菜蜂花粉水提醇沉物的分離

2.2.1大孔樹(shù)脂AB-8柱的分離水提乙醇沉淀物加適量去離子水超聲處理，過(guò)280目篩，上大孔樹(shù)脂AB-8柱（10 cm×150 cm），流量20 mL/min，依次用去離子水，體積分?jǐn)?shù)10%、95%乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，用100 mL的三角瓶依次進(jìn)行收集，用苯酚—硫酸法跟蹤檢測(cè)多糖，收集含多糖部分［10］。

2.2.2DEAE-纖維素凝膠柱的分離多糖組分經(jīng)濃縮后，上DEAE-纖維素凝膠柱（D 3 cm×100 cm），流量5 mL/min。分別用去離子水、0.1、0.2、0.3 mol/L的氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，流量5 mL/min，自動(dòng)分部收集器15 mL/每管收集，經(jīng)苯酚-硫酸法檢測(cè)，合并收集各含糖的峰。

2.2.3HW-55F色譜柱的分離將含多糖的主要峰組分濃縮，過(guò)濾后上HW-55F（D 3 cm×100 cm）色譜柱，流量5 mL/min。用去離子水洗脫，流量5 mL/ min，15 mL/管收集洗脫液，苯酚-硫酸法檢測(cè)洗脫液。經(jīng)HW-55F色譜柱分離的多糖組分，再經(jīng)Sephacryl S-400（3 cm×100 cm）色譜柱色譜柱多次純化，分離得到多糖化合物A。

2.3純度鑒定

2.3.1Sephadex G-100色譜柱鑒定將多糖化合物A上Sephadex G-100色譜柱鑒定其純度，流速為2 mL/min，去離子水洗脫。苯酚-硫酸法檢驗(yàn)。

2.3.2紫外光譜分析配制0.5 mg/mL多糖A溶液，利用分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，波長(zhǎng)范圍為200～400 nm，觀察260 nm和280 nm處的吸收峰。

2.4多糖化合物A免疫活性測(cè)定

采用清潔級(jí)昆明小鼠（雌雄各半）40只，分為正常組（10只）、環(huán)磷酰胺（CTX）模型組（10只）、環(huán)磷酰胺（CTX）-水提醇沉組（10只）、磷酰胺（CTX）-多糖A組（10只）。CTX-水提醇沉物組每天灌胃油菜蜂花粉水提醇沉物250 mg/Kg，正常組與模型組每天灌胃等量的生理鹽水。第10天時(shí)，給模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺150 mg/kg，正常組小鼠腹腔注射等量的生理鹽水。注射環(huán)磷酰胺后第4天最后一次灌胃，禁食12 h后小鼠稱(chēng)重，眼球采血，斷頸處死，制備血清，采用單向瓊脂擴(kuò)散法比較小鼠血清中的IgG含量。取出小鼠的胸腺、脾臟稱(chēng)重，計(jì)算其胸腺脾臟指數(shù)并用spss16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果用x±s表示［3，11-14］。

2.5結(jié)構(gòu)鑒定

所得的化合物以氘代吡啶為溶劑，四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)物，在核磁共振儀上進(jìn)行1H-NMR、13C-NMR和135DEPT-NMR分析。

3　結(jié)果與討論

3.1水提醇沉物成分分離

3.1.1DEAE-纖維素凝膠柱的分離結(jié)果水提醇沉物過(guò)大孔樹(shù)脂AB-8柱，水洗部分用DEAE-纖維素凝膠柱分離，經(jīng)去離子水和氯化鈉溶液梯度洗脫，得如圖1所示的洗脫曲線(xiàn)。從圖中可以看到各梯度鹽溶液的洗脫峰，由洗脫液的吸光度值可知，多糖組分主要集中在水洗部分。由于氯化鈉洗脫部分的多糖含量較少，因此將水洗部分多糖作為進(jìn)一步研究對(duì)象。

圖1　DEAE-纖維素凝膠柱洗脫曲線(xiàn)Fig.1Elution curve of DEAE-cellulose gel column

3.1.2HW-55F柱分離結(jié)果將DEAE-纖維素凝膠柱分離出的水洗部分，過(guò)HW-55F柱，用苯酚-硫酸法檢測(cè)得如圖2所示的洗脫結(jié)果。由圖可知，洗脫液主要有一個(gè)多糖峰，取此峰段合并。

圖2　HW-55F柱洗脫曲線(xiàn)Fig.2Elution curve of HW-55F column

3.1.3Sephacryl S-400的分離結(jié)果將HW-55F柱分離得到的多糖，經(jīng)Sephacryl S-400柱反復(fù)純化，最終得到油菜蜂花粉多糖A，經(jīng)苯酚-硫酸法檢測(cè)所得洗脫曲線(xiàn)如圖3所示。從圖中可知，多糖A具有單一對(duì)稱(chēng)蜂，表明多糖A已分純。

圖3　多糖經(jīng)Sephacryl S-400柱洗脫曲線(xiàn)Fig.3Elution curve of polysaccharide A by Sephacryl S-400 column

3.2紫外光譜分析結(jié)果

將多糖A溶液在波長(zhǎng)200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，得如圖4所示結(jié)果。圖中顯示，260 nm、280 nm波長(zhǎng)處均無(wú)吸收峰，說(shuō)明多糖A不含蛋白質(zhì)和核酸。

3.3多糖A免疫活性測(cè)定

油菜蜂花粉多糖A對(duì)免疫抑制小鼠胸腺、脾臟指數(shù)及血清IgG水平的影響結(jié)果見(jiàn)表1，由表1可知多糖A組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及小鼠血清IgG水平均顯著高于模型組（P＜0.01），且與正常組小鼠的各項(xiàng)指數(shù)沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。水提醇沉物組小鼠胸腺指數(shù)及血清IgG水平均顯著高于模型組（P＜0.01），脾臟指數(shù)顯著高于模型組小鼠（P＜0.05），各項(xiàng)指標(biāo)與正常組小鼠沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。表明多糖A及水提醇沉物均可將小鼠的胸腺、脾臟重量及血清IgG水平（P＜0.05）恢復(fù)到正常水平。且多糖組小鼠的血清IgG水平顯著高于水提醇沉物組（P＜0.05），說(shuō)明油菜蜂花粉多糖在純化后免疫活性更顯著。

圖4　多糖A紫外吸收?qǐng)D譜Fig.4UV absorption spectrum of polysaccharide A

表1　小鼠胸腺、脾臟指數(shù)及血清IgG水平（x±s）Table 1Level of serum IgG and thymus index and spleen index of mice（x±s）

注：a代表差異為P＜0.01，b代表差異為P＜0.05，均與模型組比較。*代表差異為P＜0.05，與水提醇沉物組比較。

3.4多糖A結(jié)構(gòu)鑒定

多糖A為白色粉末，無(wú)揮發(fā)性，無(wú)甜味，易溶于水，難溶于丙酮、乙醇、乙醚。

多糖A的1H-NMR見(jiàn)圖6，由圖6可見(jiàn)δ 3.5～4.3有6個(gè)質(zhì)子信號(hào)，這些信號(hào)為糖上質(zhì)子信號(hào)，δ 4.5～5.5未見(jiàn)質(zhì)子信號(hào)，說(shuō)明該物質(zhì)無(wú)端基質(zhì)子，進(jìn)一步得出多糖A為酮糖糖醇類(lèi)。其13C-NMR見(jiàn)圖7，其數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，由碳信號(hào)數(shù)據(jù)可見(jiàn)，多糖A共6個(gè)碳信號(hào)，180.84處為一羧基信號(hào)，76.47、74.90、73.72、73.38、65.16為連氧碳信號(hào)，表明多糖A為糖醛酸。其135DEPT見(jiàn)圖8，65.2處為CH2信號(hào)，這些信號(hào)表明多糖A不是普通的環(huán)狀呋喃或吡喃糖，由于未見(jiàn)端基碳信號(hào)，應(yīng)該為直鏈型?？梢酝茢嗥淦谓Y(jié)構(gòu)為：HOCH2-［CHOH］4-COOH。

多糖連接方式的分析：從洗脫過(guò)程中可見(jiàn)，在DEAE色譜柱中是用水洗脫的，表明該多糖為中性多糖，可推測(cè)-COOH參與成鍵因而不表現(xiàn)酸性多糖性質(zhì)，故得出如圖5所示的重復(fù)結(jié)構(gòu)。

表2　多糖A在13C-NMR中的碳信號(hào)Table 2Signals of carbon in the13C-NMR of A

圖5　多糖A的結(jié)構(gòu)式Fig.5Structure of polysaccharide A

圖6　多糖A的1H-NMR譜圖Fig.61H-NMR spectrum of compound polysaccharide A

圖7　多糖A的13C-NMR譜圖Fig.713C-NMR spectrum of polysaccharide A

圖8　多糖A的135DEPT-NMR譜圖Fig.8135DEPT-NMR spectrum of polysaccharide A

4　討論

［1］王開(kāi)發(fā).花粉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與食療［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008.

［2］王憲增.解讀花粉［M］.北京：北京大學(xué)出版社，2005.

［3］ZHAO Xue，LIANG Manfei，YANG Pingping，et al.Taishan Pinus massoniana pollen polysaccharides promote immune responses of recombinant Bordetella avium ompA in BALB/c mice［J］.International Immunopharmacology，2013，17：793-798.

［4］LI Fei，YUAN Qipeng，F(xiàn)arzana Rashid.Isolation，purification and immunobiological activity of a new water-soluble bee pollen polysaccharide from Crataegus pinnatifida Bge［J］.Carbohydrate Polymers，2009，78：80-88.

［5］汪磊，朱波，王國(guó)澤，等.油菜花粉保健功能研究進(jìn)展［J］.糧食與油脂，2012，11：5-7.

WANG Lei，ZHU Bo，WANG Guoze，et al.Research progress on health protecting functions of rape pollen［J］.Grain and Oil，2012，11：5-7.（in Chinese）

［6］楊曉萍，吳謀成.油菜花粉多糖抗腫瘤作用的研究［J］.營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2006，28（2）：160-166.

YANG Xiaoping，WU Moucheng.Study on the antitumor effect of rape bee-pollen polysaccharide in tumor bearing Mice［J］. Journal of Nutrition，2006，28（2）：160-166.（in Chinese）

［7］楊曉萍，羅祖友，吳謀成.油菜花粉多糖的制備及其對(duì)荷瘤小鼠的影響［J］.食品科學(xué)，2005，26（12）：202-204.

YANG Xiaoping，LUO Zuyou，WU Moucheng.Study on preparation of rape pollen polysaccharide and its effect on tumor-bearing mice［J］.Food and Science，2005，26（12）：202-204.（in Chinese）

［8］劉嘉，李銳，李鑾熙，等.蜂花粉多糖的研究進(jìn)展［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（11）：125-127.

LIU Jia，LI Rui，LI Luanxi，et al.Study progress on functional polysaccharide of bee pollen［J］.Guangdong Agricultural Science，2012（11）：125-127.（in Chinese）

［9］馮慧，焦士蓉，唐遠(yuǎn)謀，等.油菜花粉研究進(jìn)展［J］.食品工業(yè)，2011（9）：108-110.

FENG Hui，JIAO Shirong，TANG Yuanmou，et al.Advance studying of rape pollen［J］.Food Industry，2011（9）：108-110.（in Chinese）

［10］李靖宇，楊穎，賈琳斐，等.板栗多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)分析及抗疲勞作用的研究［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2013，32（7）：767-771.

LI Qingyu，YANG Ying，JIA Linfei，et al.Purification，structural analysis and antifatigue assay of polysaccharide from castanea mollissima blume［J］.Journal of Food Science and Biotechnology，2013，32（7）：767-771.（in Chinese）

［11］錢(qián)之玉.藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)與指導(dǎo)［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2003，8（1）：139.

［12］鄭建仙.功能性食品［M］.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1999，9：105.

［13］陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011，12：738-739.

［14］YANG Xiaoping，GUO Dayong，ZHANG Jinming，et al.Characterization and antitumor activity of pollen polysaccharide［J］. International Immunopharmacology，2007，7：427-434.

Isolate，Identify and the Immune Improving Activity of Polysaccharides from Rape Bee Pollen

WU Panpan，DUAN Yuanfeng，XU Deping*
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Rape bee pollen was powered and extracted by 95%ethanol under reflux，then extracting the filer residue by deionized water under 60℃.Adding 95%ethanol into the extract，rested and layered，then acquired the ethanol sediment of rape bee pollen.Isolating the ethanol sediment with DEAE-cellulose column，HW-55F chromatographic column，Sephacryl chromatographic column and Sepharose chromatographic column，acquired one main polysaccharide compound.Identifing the purity of this compound by Sephadex G-100 chromatographic column and ultraviolet spectral analysis，then using nuclear magnetic mathod to analyse the1H-NMR、13C-NMR and135DEPT-NMR of this compound，obtained its structural formula：HOCH2-［CHOH］4-COOH.Irrigating the immune suppression mice with this component of rape bee pollen，results showed that this component of rape bee pollen could improve the thymus index（P＜0.01），spleen index（P＜0.01）and serum IgG level（P＜0.01）of immune suppression mice significantly.

rape bee pollen，immune activity，isolation，polysaccharide

TM 344.1

A

1673—1689（2015）10—1040—05

2014-08-15

國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2007BAD83B02）。

徐德平（1965—），男，安徽宣城人，工學(xué)博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。E-mail：xdp1219@sina.com