張顯，龍水清，饒志明*，3，楊套偉，徐美娟

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；3.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇無錫214122）

定點(diǎn)突變提高枯草芽孢桿菌L-天冬酰胺酶的活力及穩(wěn)定性

張顯1，2，龍水清1，2，饒志明*1，2，3，楊套偉1，2，徐美娟1，2

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；3.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇無錫214122）

L-天冬酰胺酶可以催化L-天冬酰胺轉(zhuǎn)化為L-天冬氨酸和氨。它可以通過降解食品原料中的L-天冬酰胺而降低高溫烹制食品中丙烯酰胺的含量。由于食品預(yù)處理環(huán)境的復(fù)雜性，只有具有高酶活且穩(wěn)定的酶才能滿足食品生產(chǎn)中的應(yīng)用。作者通過點(diǎn)突變提高來源于Bacillus subtilis B11-06的L-天冬酰胺酶（BsAII）的酶活和熱穩(wěn)定性。通過序列比對(duì)和同源模擬選擇5個(gè)點(diǎn)進(jìn)行突變，構(gòu)建6個(gè)突變菌株。酶活測定結(jié)果表明，突變體酶S299Nansz和P348Aansz的酶活較BsAII分別提高28%和32%。其中P348Aansz的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性較BsAII均有明顯提高。本研究表明，第299和348位氨基酸殘基對(duì)酶的催化作用有較大影響，對(duì)該酶的催化機(jī)理的研究提供了一定的基礎(chǔ)，并提高了該酶的工業(yè)應(yīng)用潛力。

L-天冬酰胺酶；定點(diǎn)突變；熱穩(wěn)定性；pH穩(wěn)定性

L-天冬酰胺酶II（L-Asparaginase II，EC 3.5.1.1）可以催化L-天冬酰胺脫氨基轉(zhuǎn)化成L-天冬氨酸和氨，該酶具有抗腫瘤活性，已被應(yīng)用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病及霍金森病等。最新報(bào)道該酶也可用于減少高溫制作食品中丙烯酰胺的生成。近年來，丙烯酰胺由于對(duì)人體潛在的致癌作用而引起人們的關(guān)注［1-2］。丙烯酰胺在高溫烘烤及油炸食品中含量較高，它主要是由天冬酰胺和還原糖通過美拉德反應(yīng)生成。美拉德反應(yīng)是一種普遍的非酶褐變現(xiàn)象，是油炸及烘烤食品色味的主要形成途徑［3］。研究表明，L-天冬酰胺酶通過將天冬酰胺轉(zhuǎn)化成天冬氨酸，有效降低食品中丙烯酰胺的含量而影響其色味的形成［4-5］。

目前，由Aspergillus oryzae和Aspergillus niger所產(chǎn)的L-天冬酰胺酶由于其優(yōu)良特性已被人們普遍接受，如在pH 6.0～7.0、60℃條件下有較高的酶活［6-7］。但是由于高溫、強(qiáng)酸堿、高鹽、溶劑毒性等復(fù)雜的食品預(yù)處理環(huán)境，只有高酶活、耐高溫、耐酸堿的天冬酰胺酶才具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

作者所在實(shí)驗(yàn)室在前期研究工作中將來源于枯草芽孢桿菌中的L-天冬酰胺酶II（BsAII）基因通過表達(dá)質(zhì)粒載體pMA5在Bacillus subtilis 168中實(shí)現(xiàn)過量表達(dá)，經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化后在5 L發(fā)酵罐中酶活達(dá)到89.48 U/mL。Gilbert將來源于Erwinia chrysanthemi中的天冬酰胺酶基因在E.coli和Erwinia carotovora中實(shí)現(xiàn)重組表達(dá)酶活分別為49、20.2 U/mL［8-9］。Hatanaka等克隆來源于Streptomyces中的天冬酰胺酶基因并在E.coli中實(shí)現(xiàn)重組表達(dá)，酶活達(dá)到23.02 U/mL。因此與其它研究相比，作者所在實(shí)驗(yàn)室的重組菌所產(chǎn)L-天冬酰胺酶具有更高的酶活，并且枯草芽孢桿菌為GRAS菌株，已被廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵行業(yè)，其安全性已得到廣泛認(rèn)可［10］。但是與已經(jīng)工業(yè)化的L-天冬酰胺酶相比，本研究得到的L-天冬酰胺酶II的酶活和熱穩(wěn)定性還有待提高。

蛋白質(zhì)工程是用于克服天然酶在工業(yè)應(yīng)用過程中缺陷的重要手段，通常改造蛋白質(zhì)的策略主要包括定點(diǎn)突變、定向進(jìn)化等［11］。II型L-天冬酰胺酶屬于同源四聚體，相鄰兩個(gè)單體形成兩個(gè)活性中心區(qū)域［12］。每個(gè)催化中心由一個(gè)單體的C端區(qū)域與相鄰單體的N端區(qū)域形成［13］。雖然每個(gè)“二聚體”都有兩個(gè)活性中心區(qū)域，但只有具有四聚體結(jié)構(gòu)的酶才有酶活［14］。由此，我們推斷在該蛋白三維結(jié)構(gòu)中距離酶催化活性中心區(qū)域較近的氨基酸殘基對(duì)酶的穩(wěn)定性和酶活可能具有重要的影響。近年來，研究者已經(jīng)對(duì)L-天冬酰胺酶的催化機(jī)理進(jìn)行了深入的研究，通過分析不同來源的L-天冬酰胺酶的晶體結(jié)構(gòu)并結(jié)合點(diǎn)突變研究明確了該酶的催化活性中心位點(diǎn)。例如來源于E.coli的天冬酰胺酶的活性位點(diǎn)分別為：T12、Y25、S58、T89、D90、K162［14-17］。通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，不同來源的L-天冬酰胺酶的活性位點(diǎn)高度保守。因此，我們決定采用定點(diǎn)突變手段改造L-天冬酰胺酶II來提高其酶活和熱穩(wěn)定性，以提高其工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。采用序列比對(duì)和同源模擬來選擇突變位點(diǎn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，突變體酶S299Nansz和P348Aansz的酶活和穩(wěn)定性較原始酶都有所提高。

1　材料與方法

1.1材料

pMA5載體，大腸桿菌JM109、枯草芽孢桿菌Bacilus subtilis 168：作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。B am HI、M lu I等限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶等：購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒，膠回收試劑盒等：購自Generay公司；其余為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1定點(diǎn)突變和重組質(zhì)粒的構(gòu)建以實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMA5-ansz為模板，設(shè)計(jì)兩條相互有重疊部分的含突變點(diǎn)的引物，見表1，利用突變引物通過重疊延伸PCR引進(jìn)突變點(diǎn)［18］。

表1　基因克隆及定點(diǎn)突變引物Table 1 Primers used for site-directed mutagenesis and gene cloning

將相應(yīng)的重疊延伸PCR產(chǎn)物及大腸-枯草穿梭質(zhì)粒pMA5用Bam HI、M lu I進(jìn)行雙酶切，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌JM109中，挑單克隆提質(zhì)粒，并將質(zhì)粒送往上海生工進(jìn)行測序。經(jīng)測序后，將正確突變質(zhì)粒利用化學(xué)法轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 168感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)［19］。

1.2.2L-天冬酰胺酶的表達(dá)和純化將重組菌接種至含有50μg/mL Kan的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37℃，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min，培養(yǎng)24 h，離心收集菌體，上清液作為胞外粗酶液，菌體破碎液為胞內(nèi)粗酶液，粗酶液可以用于酶活測定、SDS-PAGE分析或者-20℃保藏。酶的純化采用文獻(xiàn)［20］所述方法。

1.2.3L-天冬酰胺酶酶活的測定L-天冬酰胺酶酶活測定采用奈斯勒試劑法［12］。酶促反應(yīng)體系1 mL：400μL 50 mmol/L L-Asn、400μL 50 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、100μL適當(dāng)稀釋酶液，在40℃水浴中反應(yīng)15min，加入100μL 15 g/dL三氯乙酸終止反應(yīng)，對(duì)照管在水浴反應(yīng)之前加入100μL 15 g/dL三氯乙酸。反應(yīng)終止后在20 000 r/min條件下離心10 min，取200μL上清液加入到4.8 mL去離子水中，加入200μL奈斯勒試劑，利用分光光度計(jì)測定450 nm下的吸光度。酶活單位：在酶反應(yīng)條件下，單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生1μmol/L NH3所需的酶量為1個(gè)酶活單位。蛋白質(zhì)濃度采用Bradford法測定［21］。

1.2.4最適溫度及溫度穩(wěn)定性在pH 7.5條件下，將純酶液添加到反應(yīng)體系中，將反應(yīng)體系分別置于20、30、35、40、50、60℃下反應(yīng)15 min，反應(yīng)結(jié)束后測定酶活，分析不同反應(yīng)溫度對(duì)重組L-天冬酰胺酶催化反應(yīng)的影響，獲得此酶的最適反應(yīng)溫度。將純酶液分別放置在30、40、50、60℃水浴鍋中，每隔一段時(shí)間取樣，測定酶活，考察重組酶在不同溫度下的穩(wěn)定性。

1.2.5最適pH及pH穩(wěn)定性將純酶液分別加入到不同pH緩沖液中（pH 4.0～6.0，0.05 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；pH 6.0～7.0，0.05 mmol/L磷酸鹽緩沖液；pH 7.0～9.0，0.05 mmol/L Tris-HCl緩沖液；pH 9.0～10.0，0.05 mmol/L甘氨酸-NaOH緩沖液）于40℃反應(yīng)15 min，奈斯勒試劑測定酶活，考察不同pH緩沖液對(duì)重組L-天冬酰胺酶催化反應(yīng)的影響，獲得重組酶的最適反應(yīng)pH。將純酶液加入到pH 6.0～10.0的緩沖液中，在4℃下放置12 h，測剩余酶活，考察重組酶在不同pH下的穩(wěn)定性。

1.2.6動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定配制不同濃度的L-Asn溶液，加入過量的純酶液，反應(yīng)體系置于最適條件下反應(yīng)，通過奈斯勒試劑測定產(chǎn)物氨的增加量，通過Lineweaver-Burk作圖法計(jì)算獲得的Km和kcat值。

1.2.7三維結(jié)構(gòu)模擬及分析將BsAII的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL服務(wù)器得到其三維結(jié)構(gòu)。利用ClustalW2軟件進(jìn)行序列比對(duì)。利用PYMOL軟件分析氨基酸殘基間氫鍵相互作用。

2　結(jié)果與討論

2.1突變位點(diǎn)的選擇

將BsAII的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL服務(wù)器，以與其序列相似度達(dá)到59.75%的同源四聚體蛋白（PDB id：1jsr，分辨率為1.70?）為模板得到其三維結(jié)構(gòu)模型，見圖1。Chou-Fasman根據(jù)各個(gè)氨基酸在一些已知結(jié)構(gòu)的蛋白中的表現(xiàn)，按構(gòu)象參數(shù)由大到小分組，總結(jié)出Gly和Pro是α-螺旋的強(qiáng)破壞者，而Ala是α-螺旋的強(qiáng)形成者［22］。Gly由于側(cè)鏈太小，構(gòu)象不穩(wěn)定，而Pro由于其亞氨基少一個(gè)氫原子，無法形成氫鍵，也是α-螺旋的強(qiáng)破壞者。與Gly相比，Ala能夠在折疊時(shí)包埋更大的極性區(qū)域，以及其更低的折疊熵，因而能夠穩(wěn)定α-螺旋；與Pro相比，Ala由于側(cè)鏈較小，不會(huì)增加蛋白骨架的構(gòu)象變化，從而穩(wěn)定α-螺旋［23］。因此我們根據(jù)同源模擬結(jié)果選擇位于α-螺旋區(qū)域且距離活性中心較近的Gly和Pro將其突變?yōu)锳la，分別構(gòu)建突變菌株G177A、P178A、P348A。

近年來，許多研究者已經(jīng)對(duì)L-天冬酰胺酶的催化機(jī)理進(jìn)行了深入的研究，活性位點(diǎn)較為明確，因此我們選擇幾個(gè)活性較高的L-天冬酰胺酶的氨基酸序列與BsAII進(jìn)行序列對(duì)比，結(jié)果見圖2。圖2黑色框中的氨基酸殘基為活性中心位點(diǎn)，在BsAII中為T61、Y75、S108、T141、D142、K214、S299、D334。通過序列比對(duì)我們發(fā)現(xiàn)除了第299與334位外，其余活性中心位點(diǎn)在不同來源的L-天冬酰胺酶氨基酸序列中非常保守。鑒于其它三個(gè)來源的L-天冬酰胺酶活性較高，因此我們把BsAII的第299和334位氨基酸殘基突變成相應(yīng)的氨基酸殘基，分別構(gòu)建突變菌株：S299N、D334E、D334G。

圖1　BsAII三維結(jié)構(gòu)Fig.1　Stereo representation of the native enzyme BsAII

圖2　不同來源L-天冬酰胺酶氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Fig.2　Sequences alignment of L-asparaginases from different bacteria

2.2L-天冬酰胺酶的表達(dá)與純化

將6個(gè)突變株表達(dá)純化后，通過分析SDSPAGE電泳圖譜發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)目的條帶均在38 000左右，與理論值相符，見圖3。

圖3　突變體蛋白質(zhì)純化結(jié)果Fig.3　Purification ofmutan t enzymes

2.3L-天冬酰胺酶最適溫度及溫度穩(wěn)定性

在40℃、pH 7.5條件下測定6個(gè)突變體酶及原始酶酶活，結(jié)果表明S299Nansz（115.78 U/mg）、P348Aansz（119.39 U/mg）比酶活分別比原始酶（90.45 U/mg）提高28%和32%，而其余突變體酶比酶活均比原始酶有所降低。第299和334位氨基酸殘基的改變并沒有引起酶活的大幅度降低，這說明這兩個(gè)位點(diǎn)可能不是酶催化所必須的，或者是突變后其它位點(diǎn)的氨基酸殘基補(bǔ)償了這兩個(gè)位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)變化。因此，我們選擇突變體酶S299Nansz和P348Aansz做進(jìn)一步研究。如圖4所示，突變體酶S299Nansz、P348Aansz和原始酶BsAII的最適溫度均為40℃。在20～50℃之間酶活都在60%以上，到60℃時(shí)酶活急劇下降，說明高溫已經(jīng)開始破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，對(duì)酶促反應(yīng)造成較大的影響。

為了比較這三個(gè)酶的溫度穩(wěn)定性，我們測定了它們?cè)诓煌瑴囟认碌陌胨テ?，結(jié)果見表2。從表2可以看出，在30～50℃之間突變體酶P348Aansz的溫度穩(wěn)定性較BsAII都有較大的提高，而60℃時(shí)，P348Aansz的穩(wěn)定性較BsAII有所下降，而突變體酶S299Nansz的熱穩(wěn)定性較原始酶變化不大。這說明第348位氨基酸殘基所在的α螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)酶的溫度穩(wěn)定性有重要作用。在低溫時(shí)可以較好地維持蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，而在高溫時(shí)三維結(jié)構(gòu)受到急劇破壞。

圖4　突變體酶的最適反應(yīng)溫度Fig.4　Optimal tem perature of the wild-type enzyme and its varian ts

表2　突變體酶在不同溫度下的半衰時(shí)間Table 2 Half-lives of w ild-type enzyme and itsmutants for thermal inactivation

2.4L-天冬酰胺酶最適pH及pH穩(wěn)定性

如圖5所示，突變體酶S299Nansz的最適pH為7.5，而P348Aansz的最適pH為8.0。突變體酶S299Nansz與P348Aansz在pH 5～9之間都具有50%以上的酶活。

圖5　突變體酶的最適pH值Fig.5 Optimal pH of the w ild-type enzym e and its variants

為了比較三個(gè)酶的pH穩(wěn)定性，我們測定了三個(gè)酶在pH 6～10范圍內(nèi)放置12 h后的殘余酶活，見圖6。從圖6可以看出，三個(gè)酶在pH 8～10范圍內(nèi)放置12 h后都保留70%以上的酶活，這表明該酶在偏堿性的條件下較穩(wěn)定。突變體酶P348Aansz在pH 6～10范圍內(nèi)酶活均在70%以上，這說明突變后酶的耐酸堿能力也得到了較大的提高。

圖6　突變體酶pH穩(wěn)定性Fig.6 pH stability of thew ild-typeenzymeand itsvariants

2.5L-天冬酰胺酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

作者對(duì)突變體酶和原始酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行了研究。如表3所示，突變體酶S299Nansz與P348Aansz的Km值均比原始酶有所提高，這表明突變后酶對(duì)底物的親和力有所下降。而kcat/Km值均比原始酶高，這表明突變后酶促反應(yīng)的催化效率有所提高，催化效率的提高可能是引起酶活提高的主要原因。

表3　突變體酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab le 3 K inetics of the w ild-type enzym e and its variants

2.6突變體酶的三維結(jié)構(gòu)分析

酶活性中心及其附近區(qū)域的高柔性可能會(huì)表現(xiàn)出高的比酶活和低的活化能［24］。為了解釋比酶活提高的原因，我們分析了點(diǎn)突變前后氫鍵的變化。從圖7可以看出，突變前S299與周圍氨基酸殘基形成4個(gè)氫鍵，而突變后N299僅與周圍氨基酸殘基形成1個(gè)氫鍵。由于第299位氨基酸殘基可能參與酶與底物的結(jié)合［18］，其與周圍氨基酸殘基氫鍵相互作用的減弱，可能造成酶與底物結(jié)合區(qū)域柔性的增大，從而增強(qiáng)酶對(duì)底物的捕捉或?qū)Ξa(chǎn)物的釋放，這可能是引起酶活提高的主要原因。

第348位氨基酸氨基位于α-螺旋中，將P348突變?yōu)锳348后，酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性都得到大幅度提高，這表明該位點(diǎn)對(duì)酶維持三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定具有重要的作用。這一結(jié)果也與文獻(xiàn)［22］相符。

圖7　第299位氨基酸殘基突變前后氫鍵變化Fig.7 Changes of hydrogen bond interactions between residue at 299 and other residues after mutation

3　結(jié)語

本研究通過定點(diǎn)突變提高了枯草芽孢桿菌L-天冬酰胺酶的活力及穩(wěn)定性，提高了該酶的工業(yè)應(yīng)用潛力。通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬和分子間作用力分析，證明了L-天冬酰胺酶催化活性中心底物結(jié)合區(qū)域的柔性結(jié)構(gòu)對(duì)酶活力有較大的促進(jìn)作用，而位于α-螺旋上的脯氨酸（P348）對(duì)該酶的熱穩(wěn)定性有較大影響。本研究為其它來源的L-天冬酰胺酶的改造提供了相應(yīng)的理論依據(jù)。

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Improving the Activity and Stability of L-Asparaginase from Bacillus subtilis by Site-Directed Mutagenesis

ZHANG Xian1，2，LONG Shuiqing1，2，RAO Zhiming*1，2，3，YANG Taowei1，2，XU Meijuan1，2
（1.Schoolof Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi214122，China；2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

L-Asparaginase catalyzes thehydrolysis of L-asparagine to L-aspartic acid and ammonia，which can hydrolyze free L-Asn to aspartic acid and decrease acrylam ide formation during food processingd.In order tomeet the high requirementsand complicated procedures of food processing，the activity and stability of L-Asparaginase need to beimproved.In this study，we successfully improved the enzymeactivity and stability of L-asparaginase（BsAII）from Bacillus subtilis B11-06by site-directedmutagenesis.Five residues of BsAIIwere selected and used to construct themutants by sequence alignmentand homologymodeling.The enzyme activity assayshowed that the enzyme activity of S299Nanszand P348Aaanszwere increased by 28%and 32%，respectively，as compared to the BsAII.The thermal stability and pH stability of P348Aanszwere significantly improved compared to thatof BsAII.This study showed that residues 299 and 348 in am ino acid sequence of BsAIIhad a great influence on the catalytic action，which provided a basis for the study of the catalytic mechanism of theenzyme，and extended theapplication in food industry.

L-asparaginase，site-directedmutagenesis，thermalstability，pH stability

Q789

A

1673—1689（2015）11—1128—07

2015-05-12

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31500065）；國家863計(jì)劃項(xiàng)目（SS2015AA021004）；中國博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2015M570407）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（JUSRP11545）；工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（KLIB-KF201406）。

張顯（1986—），男，江蘇徐州人，工學(xué)博士，講師，主要從事微生物代謝工程和生物催化開發(fā)方面的研究。

E-mail：zx@jiangnan.edu.cn

饒志明（1975—），男，江西臨川人，農(nóng)學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事應(yīng)用微生物與代謝工程方面的研究。

E-mail：raozhm@jiangnan.edu.cn