田海龍，孫偉，高穎，李玲，李英，陳麗君，陳茂深，鐘芳

（1.山東瑞博斯煙草有限公司，山東臨沂276400；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

造紙法再造煙葉涂布液中腐敗菌的分離鑒定與抑菌

田海龍1，孫偉1，高穎1，李玲1，李英1，陳麗君1，陳茂深2，鐘芳2

（1.山東瑞博斯煙草有限公司，山東臨沂276400；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

采用平板劃線分離方法對造紙法再造煙葉涂布液中的主要微生物群進(jìn)行分離，再根據(jù)細(xì)菌的菌落形態(tài)、菌體形態(tài)、生理生化實驗和16S rDNA序列分析對菌株進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，鑒定出引起涂布液腐敗的細(xì)菌為短小芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和肺炎克雷伯菌，其中肺炎克雷伯菌為主要腐敗菌。此外，還考察了山梨酸鉀、雙乙酸鈉、尼泊金酯鈉、乙二胺四乙酸二鈉和ε-聚賴氨酸等5種防腐劑對肺炎克雷伯菌的抑菌效果。結(jié)果表明，5種防腐劑的抑菌效果強(qiáng)弱順序為ε-聚賴氨酸＞乙二胺四乙酸二鈉＞雙乙酸鈉＞山梨酸鉀＞尼泊金酯鈉，其中ε-聚賴氨酸對肺炎克雷伯菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為0.075 mg/mL。

涂布液；細(xì)菌；分離；鑒定；抑菌

煙葉是一種經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物，在收獲過程中會產(chǎn)生約5%的次級煙葉［1］。此外，在卷煙的生產(chǎn)加工過程中，也會產(chǎn)生大約占原料總量1/3的煙梗和煙末等煙草碎屑［2］。為了提高卷煙產(chǎn)品的品質(zhì)、節(jié)約耕地、降低生產(chǎn)成本和原料消耗，煙草行業(yè)多年來就次級煙葉和煙草碎屑綜合利用問題進(jìn)行了大量而詳細(xì)的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)再造煙葉是實現(xiàn)廢煙料綜合利用的有效途徑。造紙法再造煙葉具有填充值高、成絲率高、密度小、機(jī)械加工性能好和焦油含量低等優(yōu)點［3］，已廣泛應(yīng)用于再造煙葉的生產(chǎn)加工過程。在造紙法再造煙葉制造過程中，煙梗和煙末分別經(jīng)水浸泡提取后，將可溶物與不溶物分離，不溶物一般會與木漿纖維混合打漿，經(jīng)抄紙機(jī)抄造制得片基，可溶物濃縮后制得涂布液，將涂布液均勻涂布在片基上，經(jīng)烘干制得再造煙葉［4］。

研究發(fā)現(xiàn)，煙草中富含葡萄糖、果糖、脯氨酸和蛋白質(zhì)［5］等微生物生長繁殖所需的碳源和氮源，因此微生物極易在涂布液中生長繁殖，致使涂布液腐敗變質(zhì)，從而影響再造煙葉的整體品質(zhì)。然而，迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于造紙法再造煙葉涂布液中腐敗微生物的相關(guān)研究報道。作者對造紙法再造煙葉涂布液中的腐敗微生物進(jìn)行了分離鑒定，同時考察了5種廣譜防腐劑對主要腐敗菌的抑菌效果，確定了它們的最小抑菌濃度，從而為造紙法再造煙葉的涂布液防腐提供相關(guān)的理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

涂布液：采自山東瑞博斯煙草有限公司的再造煙葉生產(chǎn)線；山梨酸鉀和雙乙酸鈉：均為食品級，北京北方霞光食品添加劑有限公司；尼泊金酯鈉：徐州冬荷科技有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）：中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司；ε-聚賴氨酸（ε-PL）：浙江銀象生物工程有限公司；LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母膏5 g，蒸餾水950mL，pH 7.0，121℃濕熱滅菌30 min；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

1.2儀器與設(shè)備

320-SpH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；基因組DNA快速抽提試劑盒（細(xì)菌）：生工生物工程（上海）有限公司；PYX-DHS隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；GS00001 PCR儀：GSTROM；Power pac核酸電泳儀：Bio-Rad Laboratories；Geldoc 2000凝膠成像系統(tǒng)：Bio-Rad Laboratories；DK-8D型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；M5酶標(biāo)儀：美國Molecular Devices公司。

1.3試驗方法

1.3.1取樣涂布液腐敗時，需要對其進(jìn)行更換，在每次更換前后分別對腐敗的涂布液和未腐敗的涂布液取一次樣：取200 mL涂布液于1 L已滅菌的藍(lán)蓋瓶中。腐敗的涂布液和未腐敗的涂布液各取樣3次，測定其菌落總數(shù)、pH值并觀察腐敗前后涂布液的變化。

1.3.2菌落總數(shù)的測定菌落總數(shù)測定參考GB 4789.2-2010：涂布液以10-1的梯度進(jìn)行稀釋，選擇其中3個合適的稀釋度，吸取各梯度稀釋液1 mL于平板中，采用傾注法注入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，經(jīng)37℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)，每個稀釋度做3次重復(fù)［6］。

1.3.3腐敗菌的分離純化將上述平板上的菌落逐一鏡檢，篩選出菌落形態(tài)和鏡檢形態(tài)不同的菌株，然后在培養(yǎng)基上反復(fù)進(jìn)行平板劃線分離，得到純化的單個菌落［7］。

1.3.4單菌落DNA提取選用生工生物工程（上海）有限公司的細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取單菌落DNA。

1.3.516S rDNA的PCR擴(kuò)增以提取的基因組DNA為模板，正向引物為7f：5′-CAGAGTTTGATC CTGGCT-3′，反向引物為1540r：5′-AGGAGGTGAT CCAGCCGCA-3′。選用50μL體系進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)絇CR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30 s，55℃退火35 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸8min；12℃保存10min。DNA的測序由生工生物工程（上海）有限公司完成。登陸NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/），將所測得的序列與已知序列進(jìn)行比對［8］。

1.3.6腐敗菌的抑制將腐敗菌分別在LB培養(yǎng)基中于37℃條件下培養(yǎng)24 h活化，采用平板計數(shù)法測定菌體濃度，將培養(yǎng)液稀釋為含菌體107cfu/mL的菌懸液，4℃冰箱暫存?zhèn)溆茫?］。

將5種防腐劑（山梨酸鉀、雙乙酸鈉、尼泊金酯鈉、EDTA-2Na、ε-PL）配制成質(zhì)量濃度分別為100、10、1 mg/mL的溶液，經(jīng)121℃滅菌20 min，4℃冰箱暫存?zhèn)溆?。在含?.9 mL的LB培養(yǎng)基的試管中，實驗組加入1mL防腐劑溶液，0.1 mL菌懸液；陽性對照組用無菌水取代防腐劑，陰性對照組用LB培養(yǎng)基取代菌液。所有試管中的培養(yǎng)液總體積均為10 mL，使各防腐劑的終質(zhì)量濃度分別為10、1、0.1 mg/mL。取各梯度稀釋度及陰、陽性對照組0.2mL注入無菌的96孔培養(yǎng)板中，然后于酶標(biāo)儀600 nm處37℃培養(yǎng)24 h，測定吸光值。

最低抑菌質(zhì)量濃度（MIC）的測定：首先根據(jù)防腐劑3種質(zhì)量濃度（10、1、0.1 mg/mL）的抑菌率，初步確定其MIC的范圍，在此范圍內(nèi)設(shè)定密集的質(zhì)量濃度梯度并測定其600 nm下的吸光值，樣品孔指示菌的A600值與陰性對照組無明顯差異時的質(zhì)量濃度視為最小抑菌質(zhì)量濃度。

2　結(jié)果與分析

2.1涂布液腐敗前后比較

未腐敗的涂布液和腐敗的涂布液菌落總數(shù)和pH值見表1。結(jié)果表明，涂布液腐敗之后，細(xì)菌大量繁殖，菌落總數(shù)增加了3個數(shù)量級。與新鮮涂布液相比，腐敗涂布液的pH值有所降低，同時涂布液表面伴有少量的氣泡，說明涂布液在腐敗過程中，腐敗菌有產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象發(fā)生。

表1　涂布液腐敗前后pH值和菌落總數(shù)的變化Table 1 Changes of pH and total p late count of coating solution before and after spoilage

2.2涂布液中腐敗菌的分離

根據(jù)菌落形態(tài)和鏡檢形態(tài)的不同，對營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上腐敗菌進(jìn)行篩選，分離得到3株主要腐敗菌：T1，T2和T3。根據(jù)群體特征、形態(tài)特征、革蘭氏染色結(jié)果和生理生化特征［10］，依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》（第八版和第九版）對這些腐敗菌進(jìn)行分類鑒定。3種腐敗菌的群體特征見表2?？梢钥闯觯?種腐敗菌的菌落形態(tài)存在較大的差異，其中，T3的相對數(shù)量最多，而T1和T2相對數(shù)量較少。三種腐敗菌的菌體形態(tài)特征見表3。結(jié)果表明，T3為革蘭氏陰性菌，T1和T2為革蘭氏陽性菌。

表2　腐敗菌的菌落形態(tài)和相對數(shù)量Table 2 Colony characteristics and relative number of spoilage bacteria

表3　腐敗菌的菌體形態(tài)特征Table 3 Mycelialmorphology of spoilage bacteria

2.3涂布液中腐敗菌的鑒定

對涂布液細(xì)菌16S rDNA序列測定結(jié)果進(jìn)行比對分析，結(jié)果見表4。一般來講，在菌種分類等級上，當(dāng)兩個分類單位間的16S rDNA序列同源性大于97.5%時，可以認(rèn)為是屬于同一種細(xì)菌［11-12］。從表4可以看出，分離得到的腐敗菌T1與短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）的同源性為99.9%，因此腐敗菌T1鑒定為短小芽孢桿菌。腐敗菌T2與地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）的同源性為99.6%，因此腐敗菌T2鑒定為地衣芽孢桿菌。腐敗菌T3與肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）的同源性為99.6%，因此腐敗菌T3鑒定為肺炎克雷伯菌。因此，分離得到的三種腐敗菌分別為短小芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌和肺炎克雷伯菌。

2.4涂布液中腐敗菌的確定

研究表明，煙葉及煙絲樣品中的水溶性糖主要是葡萄糖和果糖，此外還有少量的蔗糖和麥芽糖［13-14］。由上述討論可知，涂布液在腐敗過程中存在產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象，因此作者重點研究了3種腐敗菌對上述4種糖的發(fā)酵實驗，結(jié)果見表5。三種腐敗菌均可以分解4種糖產(chǎn)酸，而僅T3（肺炎克雷伯菌）可以分解4種糖產(chǎn)氣。綜合涂布液的腐敗現(xiàn)象，腐敗菌的相對數(shù)量以及腐敗菌對糖類的發(fā)酵實驗，可以認(rèn)為涂布液的腐敗主要是由T3（肺炎克雷伯菌）造成的。

2.5涂布液中腐敗菌的抑制

由上述研究可知，引起涂布液腐敗的主要腐敗菌肺炎克雷伯菌為革蘭氏陰性菌。因此，作者參考了中華人民共和國食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)（GB2760-2011），選取了對革蘭氏陰性菌具有較好抑菌性的5種廣譜防腐劑（山梨酸鉀、雙乙酸鈉、尼泊金酯鈉、EDTA-2Na和ε-PL），考察了它們對肺炎克雷伯菌的抑菌效果，結(jié)果見圖1。由圖1可知，5種防腐劑對肺炎克雷伯菌都有一定的抑菌作用，且抑菌效果隨著防腐劑質(zhì)量濃度的增大而加強(qiáng)。例如，當(dāng)雙乙酸鈉的質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時，其對肺炎克雷伯菌的抑菌率僅為3.9%，而當(dāng)質(zhì)量濃度增加到1.0 mg/m L時，其對肺炎克雷伯菌的抑菌率達(dá)到了100%。此外，從圖1還可以看出，不同的防腐劑對肺炎克雷伯菌具有不同的抑菌效果，當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0mg/mL時，雙乙酸鈉、EDTA-2Na和ε-PL的抑菌率均達(dá)到了100%，而尼泊金酯鈉和山梨酸鉀的的抑菌率分別只有46.8%和83.4%。總體看來，EDTA-2Na和ε-PL的抑菌效果明顯優(yōu)于其它防腐劑，當(dāng)它們的質(zhì)量濃度為0.1 mg/m L時，對肺炎克雷伯菌的抑菌率已達(dá)到100%，雙乙酸鈉次之，尼泊金酯鈉和山梨酸鉀的抑菌效果最不明顯。

表4　細(xì)菌16S rDNA相似度分析Tab le 4 Sim ilarity analysis of 16S rDNA of spoilage bacteria

表5　腐敗菌的生理生化特征Table 5 Physiological and biochem ical properties of spoilage bacteria

圖1　不同質(zhì)量濃度的防腐劑對腐敗菌的抑菌效果Fig.1　Antibacterial activities of food preservatives against spoilage bacteria at differen t concentrations

表6是5種防腐劑對肺炎克雷伯菌的最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC）的測定結(jié)果，MIC越低，說明相應(yīng)食品防腐劑的抑菌作用越強(qiáng)。從表6中可以看到，5種防腐劑的MIC值大小的排序為：ε-PL

表6　5種防腐劑對兩種腐敗菌的M IC值Table 6 M ICs of five food preservatives against two spoilage bacteria質(zhì)量濃度/（mg/m L）

3　結(jié)語

作者從造紙法再造煙葉涂布液中分離出3種細(xì)菌，經(jīng)菌體特征、菌落形態(tài)、生理生化實驗和16S rDNA序列分析，鑒定出引起涂布液腐敗的細(xì)菌為短小芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌和肺炎克雷伯菌，其中肺炎克雷伯菌為主要腐敗菌。此外，作者還考察了山梨酸鉀、雙乙酸鈉、尼泊金酯鈉、EDTA-2Na和ε-PL等5種防腐劑對肺炎克雷伯菌的抑菌效果。結(jié)果表明，5種防腐劑對肺炎克雷伯菌都有不同程度的抑菌效果，防腐劑質(zhì)量濃度越高其抑菌效果越好，且不同防腐劑對腐敗菌具有不同的抑菌效果?？傮w來看，5種防腐劑的抑菌效果強(qiáng)弱順序為ε-PL>EDTA-2Na>雙乙酸鈉>山梨酸鉀>尼泊金酯鈉，其中ε-PL對肺炎克雷伯菌的MIC值為0.075mg/mL。

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科技信息

加拿大批準(zhǔn)從枯草芽孢桿菌Gizα3508提取的木聚糖酶作為食品酶制劑

2015年10月19日，加拿大衛(wèi)生部發(fā)布G/SPS/N/CAN/964號通報，公布加拿大衛(wèi)生部食品司已完成了一份詳細(xì)的有關(guān)申請要求將從枯草芽孢桿菌Gizα3508提取的木聚糖酶作為允許使用的食品添加劑用于面包、面粉、全麥面粉和未標(biāo)準(zhǔn)化焙烤食品中的安全評估。

從B.枯草芽孢桿菌其它特定菌株提取的木聚糖酶早已允許使用于面包、面粉、全麥面粉和未標(biāo)準(zhǔn)化焙烤食品中。

加拿大衛(wèi)生部從得到的科學(xué)數(shù)據(jù)得出的評估結(jié)果支持從枯草芽孢桿菌Gizα3508提取的木聚糖酶的安全和有效應(yīng)用。因此加拿大衛(wèi)生部已修訂食品酶允許使用列表，并于2015年10月14日生效。

該通報的目的，是公布衛(wèi)生部的這項決定，為任何咨詢或希望提交有關(guān)該食品添加劑安全性科學(xué)新信息的人士提供適當(dāng)?shù)穆?lián)系方式，加拿大衛(wèi)生部食品司將對食品添加劑的安全使用科學(xué)新信息（包括木聚糖酶）進(jìn)行審核，所有想提交有關(guān)該食品添加劑使用科學(xué)新信息或咨詢的人士可通過書面、普通郵件或電子郵件的方式進(jìn)行。

該通報的評議截止日期為2015年12月28日，批準(zhǔn)日期：加拿大衛(wèi)生部發(fā)布食品酶允許使用列表即可合法使用，發(fā)布日期為2015年10月14日

［信息來源］廈門WTO工作站.加拿大批準(zhǔn)從枯草芽孢桿菌Gizα3508提取的木聚糖酶作為食品酶制劑［EB/OL］.（2015-10-20）.http：//www.xmtbt-sps.gov.cn/detail.asp？id=50022

Isolation，Identification and Bacteriostasis of Spoilage Bacteria in Coating Solution of Paper-Making Reconstituted Tobacco Sheet

TIAN Hailong1，SUNWei1，GAO Ying1，LILing1，LIYing1，CHEN Lijun1，CHEN Maoshen2，ZHONG Fang2
（1.Shandong Rebirth Tobacco Co.，LTD，Linyi276400，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

In this paper，the streak plate separation method was used to classify and identify the primary bacterial flora in the coating solution of paper-making reconstituted tobacco sheetaccording to colony shape，bacterial characteristics，physio-biochem ical tests as well as 16S rDNA sequence analysis.The results indicated that the spoilage bacteria in the coating solution of paper-making reconstituted tobacco sheetwere Bacillus pumilus，Bacillus licheniformis and Klebsiella pneumonia. Among them，Klebsiella pneumoniae was the main spoilage bacteria.Moreover，the antibacterial effects of five food preservatives［potassium sorbate，sodium diacetate，butylparaben sodium，EDTA-2Naandε-polylysine（ε-PL）］on the spoilage bacteriawere evaluated.The results revealed thatantibacterialactivitiesof these five preservatives ranked as follows：ε-PL＞EDTA-2Na＞sodium diacetate＞potassium sorbate＞butylparaben sodium.Them inimal inhibitory concentration ofε-PL on Klebsiella pneumoniae was0.075mg/m L.

coating soultion，bacteria，isolation，identification，bacteriostasis

TS 41+4

A

1673—1689（2015）11—1219—06

2014-05-07

中國煙草總公司科技面上項目（中煙辦〔2012〕122號）；山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技重點項目（201101003）。

田海龍（1985—），男，山東臨沂人，工學(xué)學(xué)士，工程師，主要從事造紙法再造煙葉工藝技術(shù)及質(zhì)量管理方面的研究。

E-mail：thl2003@126.com