薛春旭，陳威，周宇芳，朱鵬*

（1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波315211；2.平陽縣海洋與漁業(yè)局，浙江溫州325400；3.浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江舟山316100）

海洋細(xì)菌Pseudoalteromonas sp.NJ631膠原蛋白酶的克隆與表達(dá)

薛春旭1，陳威2，周宇芳3，朱鵬*1

（1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波315211；2.平陽縣海洋與漁業(yè)局，浙江溫州325400；3.浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江舟山316100）

對交替假單胞菌Pseudoalteromonas sp.NJ631基因組中潛在的膠原蛋白酶基因進(jìn)行克隆與表達(dá)，并鑒定重組蛋白PNJC的酶活力。根據(jù)NJ631基因組序列草圖，利用基因組信息發(fā)掘方法獲得膠原蛋白酶功能提示的編碼基因，進(jìn)而利用高效表達(dá)質(zhì)粒pET28a構(gòu)建重組表達(dá)系統(tǒng)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、親和層析純化獲得重組蛋白純化產(chǎn)物。以不溶性Ⅰ型膠原蛋白為底物，測定膠原蛋白酶酶活力。對Pseudoalteromonas sp.NJ631基因組信息挖掘，從中發(fā)現(xiàn)一條疑似編碼膠原蛋白酶的基因序列，命名為Pnjc。該基因全長1 359 BP，GC含量45.62%，編碼由452個氨基酸殘基組成的約51 000大小的膠原蛋白酶。SDS-PAGE檢測表明膠原蛋白酶PNJC在0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)下得到高效表達(dá)。經(jīng)過親和層析獲得純化重組蛋白PNJC，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度約為1 mg/mL。酶活檢測表明，PNJC的酶活力為160.34 U/mg，為標(biāo)準(zhǔn)品的70.48%。PNJC高酶活力表明Pseudoalteromonas sp.NJ631來源的膠原蛋白酶具有重要的研究價值與工業(yè)開發(fā)潛力。

交替假單胞菌；膠原蛋白酶；基因組發(fā)掘；酶活檢測

膠原蛋白酶是一類特異性作用于膠原蛋白或其它變性明膠的酶類。它在醫(yī)學(xué)［1-2］、基礎(chǔ)研究［3］、環(huán)境保護(hù)［4］等方面有著重要的研究價值和應(yīng)用潛力。膠原蛋白酶來源豐富，除動物中發(fā)現(xiàn)的膠原蛋白酶外，梭菌、弧菌等微生物也能產(chǎn)生膠原蛋白酶［5-6］。微生物種類多，特異性強，基因資源豐富，具有動物無法比擬的天然優(yōu)勢。微生物來源的膠原蛋白酶的研究開發(fā)將為我們篩選酶活更高、特異性更強的潛在工業(yè)化的膠原蛋白酶。

基因組測序技術(shù)的快速更替帶來了基因組數(shù)據(jù)的爆炸性增長，利用基因組發(fā)掘（Genome Mining）方法為膠原蛋白酶編碼基因的快速發(fā)掘及其功能研究提供了高效平臺。Janwitthayanan等［7］基于全基因組序列獲得細(xì)菌膠原蛋白酶基因，利用RT-PCR方法體外檢測其表達(dá)量，驗證了膠原蛋白酶在肺出血致病菌的存活與致病性方面起重要的作用。交替假單胞菌屬因作為海洋特有菌屬而備受關(guān)注，其基因組數(shù)據(jù)庫不斷得到擴(kuò)充［8-9］。目前，交替假單胞菌屬基因組中多有膠原蛋白酶這一功能基因的提示，但是相關(guān)基因編碼的蛋白是否具有膠原蛋白酶活性未見報道。作者從Pseudoalteromonas sp.NJ631基因組草圖出發(fā)［10］，利用基因組發(fā)掘方法獲得膠原蛋白酶基因，通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得純化蛋白并檢測其功能活性，以期驗證交替假單胞菌屬中膠原蛋白酶的活性，為該菌屬來源的膠原蛋白酶的深入研究與潛在工業(yè)應(yīng)用價值奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1菌株和質(zhì)粒

海洋細(xì)菌交替假單胞菌（Pseudoalteromonas）NJ631：分離于珍珠膜海綿（Hymeniacidon perleve），由寧波大學(xué)浙江省海洋生物工程重點實驗室保藏；大腸桿菌（Escherichia coli）Rosseta（DE3）、質(zhì)粒pET28：購自Novagen公司；大腸桿菌（E scherichia coli）Top10：購自Invitrogen公司。

1.2主要試劑和儀器

細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（K1071）、質(zhì)粒小量提取試劑盒（GK2004）：購自上海捷瑞生物工程有限公司；瓊脂糖膠DNA回收純化試劑盒（D6492）：購自O(shè)mega公司；DNA Marker、rTaq聚合酶、DNA連接酶：購自TaKaRa公司；蛋白Marker：購自碧云天生物技術(shù)研究所；限制性內(nèi)切酶BamHI和Hind III：購自NEB公司；Ni-NTA agarose購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；不溶性Ⅰ型膠原與Ⅰ型膠原蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品：購自生工生物工程（上海）有限公司；Bio-Rad DC Protein ASSAY試劑盒：購自Bio-Rad公司；其他試劑均為分析純試劑；超濾離心管Amicon Ultra-10：購自Millipore公司；；純水制備系統(tǒng)：購自美國Pall公司；臺式高速冷凍離心機：購自Sigma公司；酶標(biāo)儀：購自Thermo公司；勻漿儀Precellys 24：購自Bertin公司；PCR儀：購自杭州博日科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)：購自上海歐翔科學(xué)儀器有限公司。

1.3主要培養(yǎng)基

2216E培養(yǎng)基：0.1 g/dL酵母粉，0.5 g/dL蛋白胨，0.01 g/dL檸檬酸鐵，過濾海水，用于交替假單胞菌NJ631的培養(yǎng)；LB培養(yǎng)基：1 g/dL胰蛋白胨，0.5%酵母粉，1%氯化鈉，用于大腸桿菌Rosseta（DE3）和Top10的培養(yǎng)。

1.4交替假單胞菌NJ631基因組DNA抽提

取1 mL處于指數(shù)生長期的Pseudoalteromonas sp.NJ631菌液，按照細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取其基因組DNA。

1.5基因組中膠原蛋白酶基因的發(fā)掘

基于基因組第二代測序技術(shù)獲得的Pseudoalteromonas sp.NJ631基因組草圖，利用Glimmer3.0基因軟件預(yù)測得到4658個開放閱讀框（open reading frames，ORFs）。經(jīng)蛋白數(shù)據(jù)庫Blast比對，獲得ORF的功能提示［10］，進(jìn)而發(fā)掘潛在的具有膠原蛋白酶功能的編碼基因。將基因編碼的氨基酸序列提交NCBI獲得序列登錄號，并進(jìn)行Blast比對分析。

1.6膠原蛋白酶基因的PCR擴(kuò)增

根據(jù)膠原蛋白酶基因設(shè)計一對引物：P1：5’-CGGGATCCATGTTTGTACCAGAACTTCT-3’；P2：5’-CCCAAGCTTTTATGCCTTTTTAAAAGGAT-3’，下劃線分別為限制性內(nèi)切酶BglⅡ和XhoⅠ的酶切位點，引物由Invitrogen公司生產(chǎn)合成。以NJ631基因組為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95℃5 min；95℃30 s，51℃30 s，72℃90 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目的片段。

1.7表達(dá)載體的構(gòu)建

利用限制性內(nèi)切酶BglⅡ和XhoⅠ分別對表達(dá)質(zhì)粒pET28a和膠原蛋白酶基因進(jìn)行雙酶切，回收的酶切片段經(jīng)DNA T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosseta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。通過菌落PCR檢測篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子，獲得重組質(zhì)粒pET28a-Pnjc。核苷酸序列的測序由Invitrogen公司完成。

1.8膠原蛋白酶的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

過夜培養(yǎng)的重組表達(dá)菌液按1%接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接到20 mL含卡那霉素（25μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)。當(dāng)OD600約為0.6時，添加IPTG至終濃度分別為0.2 mmol/L和1 mmol/ L，于28℃、120 r/min培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)表達(dá)4 h。培養(yǎng)基經(jīng)離心后收集菌體，利用buffer A（25 mmol/L Tris-HCl，（pH 8.0），400 mmol/L NaCl，體積分?jǐn)?shù)10%甘油）進(jìn)行重懸。菌體細(xì)胞經(jīng)勻漿儀破碎后離心，分別收集上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測。膠原蛋白酶的純化參考McQuade等方法［11］，獲得的純化蛋白經(jīng)超濾離心管濃縮后測定蛋白質(zhì)濃度并進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.9膠原蛋白酶活性檢測

以不溶性Ⅰ型膠原蛋白為底物，采用茚三酮顯色法［12］測定膠原蛋白酶PNJC水解底物釋放的水溶性氨基酸和短肽。反應(yīng)體系：0.1 mL酶液，0.5 mL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（含50 mmol CaCl2，pH 7.5），不溶性I型膠原1 mg。37℃孵育30min，加入0.6mL 10%的三氯乙酸（TCA）終止反應(yīng)。反應(yīng)物10 000 r/min離心10 min，取上清液0.6 m L并加入0.6 mL 2 mol/L乙酸緩沖液（pH 5.4）及0.6 mL茚三酮顯色溶液，充分混合后，100℃水浴加熱15 min，冰水冷卻5 min，經(jīng)60%乙醇稀釋后于570 nm處測定吸光值。以不加目的蛋白作為陰性對照，膠原蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品作為酶活反應(yīng)的陽性對照，每組反應(yīng)均重復(fù)3次。以甘氨酸為標(biāo)準(zhǔn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

酶活力定義為：在37℃，pH值7.5條件下，每分鐘水解膠原蛋白產(chǎn)生相當(dāng)于1μg甘氨酸的酶量為1個酶活力單位（U）。

2　結(jié)果與討論

2.1NJ631基因組中膠原蛋白酶基因的發(fā)掘

根據(jù)ORF的基因功能提示，我們發(fā)現(xiàn)Pseudoalteromonas sp.NJ631基因組中含有一條完整的膠原蛋白酶編碼基因，命名為Pnjc。該基因全長1 359 bp，GC含量45.62%，編碼由452個氨基酸殘基組成的約51 000大小的膠原蛋白酶。經(jīng)Blast比對分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的膠原蛋白酶PNJC與同屬中的蛋白酶相似性均在85%以上，其中與Pseudoalteromonas piscicida中的蛋白酶相似性最高，達(dá)到99%。

2.2重組表達(dá)載體pET28a-PNJC的構(gòu)建

利用帶有酶切位點的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段大小與交替假單胞菌NJ631中膠原蛋白酶編碼基因Pnjc的序列大小相符，見圖1，表明成功獲得Pnjc基因片段。

將Pnjc與表達(dá)載體pET28a分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，回收酶切片段。經(jīng)轉(zhuǎn)化、菌落PCR檢測，篩選獲得重組轉(zhuǎn)化子。測序結(jié)果顯示pET-28a在酶切位點BglⅡ和XhoⅠ之間成功插入Pnjc基因片段且無突變點。

圖1　膠原蛋白酶編碼基因Pn jc的PCR擴(kuò)增Fig.1　PCR amplification of Pnjc DNA fragment

2.3重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)與重組蛋白純化

以pET-28a為表達(dá)載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后發(fā)現(xiàn)重組蛋白PNJC在大腸桿菌Rosseta（DE3）中得到高效表達(dá)，見圖2。在51 000附近有明顯蛋白質(zhì)條帶，與膠原蛋白酶PNJC大小相符。PNJC在IPTG誘導(dǎo)濃度為0.2 mmol/L時的表達(dá)量與1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)下的表達(dá)量相當(dāng)。細(xì)胞裂解液上清液與沉淀的分析結(jié)果表明，可溶性重組蛋白PNJC表達(dá)顯著。

圖2　重組蛋白PNJC的誘導(dǎo)表達(dá)與SDS-PAGE檢測Fig.2　Heterogeneous expression of PNJC in Rosseta

將含有重組蛋白PNJC的細(xì)胞裂解上清液上樣Ni-NTA瓊脂糖凝膠純化柱，利用PNJC碳端帶有組氨酸標(biāo)簽對其進(jìn)行親和層析純化，通過梯度洗脫獲得純化重組蛋白。SDS-PAGE檢測表明，成功獲得純化的膠原蛋白酶PNJC，見圖3。經(jīng)蛋白定量試劑盒檢測顯示純化得到的膠原蛋白酶PNJC蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度約為1mg/mL，可進(jìn)行該酶的酶活測定。

圖3　重組膠原蛋白酶PNJC的純化Fig.3　Purified recombinant collagenase PNJC

2.4膠原蛋白酶酶活測定

以不溶性Ⅰ型膠原蛋白為底物，測定純化得到的膠原蛋白酶PNJC的酶活活性。結(jié)果顯示，相較于Ⅰ型膠原蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品227.51 U/mg的酶活活性，PNJC表現(xiàn)出160.34 U/mg的酶活活性，為標(biāo)準(zhǔn)品的70.48%。這意味著Pseudoalteromonas sp.NJ631來源的膠原蛋白酶PNJC具有一定的研究價值與工業(yè)開發(fā)潛力。

表1　膠原蛋白酶PNJC的底物活性檢測Table 1 Enzym atic activity of collagenase PNJC

本研究中Pseudoalteromonas sp.NJ631基因組中膠原蛋白酶編碼基因Pnjc已提交NCBI，并獲得序列登錄號：KF439859

3　結(jié)語

膠原蛋白酶的重要應(yīng)用價值使其備受關(guān)注。本實驗首次基于Pseudoalteromonas sp.NJ631基因組草圖，利用基因組信息發(fā)掘方法獲得膠原蛋白酶編碼基因Pnjc，并通過異源表達(dá)與親和層析純化獲得重組蛋白PNJC。膠原蛋白酶PNJC的酶活力為160.34 U/mg，達(dá)到膠原蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品的70.48%，具有重要的研究開發(fā)價值。異源表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)條件的優(yōu)化、重組蛋白純化方法的改進(jìn)、氨基酸位點的突變將有助于我們獲得高質(zhì)量的具有生物活性的重組蛋白PNJC，為首個交替假單胞菌屬來源的膠原蛋白酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定堅實的基礎(chǔ)。

目前，NCBI數(shù)據(jù)庫已收錄超過7 000個物種的基因組數(shù)據(jù)，其中細(xì)菌來源的基因組數(shù)據(jù)約4 500個，后基因組時代已經(jīng)到來。較真核生物而言，細(xì)菌具有無可比擬的優(yōu)勢，細(xì)菌豐富的基因資源為潛在的功能蛋白的發(fā)掘與新型化合物的指導(dǎo)發(fā)現(xiàn)提供了充足的數(shù)據(jù)資源。而基因組信息發(fā)掘方法為如何利用細(xì)菌基因組資源獲得目的基因提供了思路，避免了通過構(gòu)建基因組文庫獲得目的基因的傳統(tǒng)方法［6］，達(dá)到快速篩選、節(jié)約時間、提高效率的目的。Rainbow等從類鼻疽桿菌基因組數(shù)據(jù)庫中發(fā)掘到一條膠原蛋白酶的編碼基因，通過基因克隆、異源表達(dá)與酶活檢測驗證了該基因編碼蛋白具有明膠酶與膠原蛋白酶活性［13］。以細(xì)菌基因組為基礎(chǔ)，借助基因組發(fā)掘技術(shù)將有助于我們快速獲得更加高效、工業(yè)化開發(fā)潛力的膠原蛋白酶。

［1］CakirM，Tekin A，Kucukkartallar T，etal.Effectivenessof collagenase in preventing postoperative intra-abdom inal adhesions［J］. International Journal of Surgery，2013，11（6）：487-491.

［2］Torrai Bou JE，Paggi B.Collagenase and devitalized tissue in the framework of the wound bed preparation［J］.Revista de Enferm ería，2013，36（2）：37-42.

［3］LeonardiR，Caltabiano R，Loreto C.Collagenase-3（MMP-13）isexpressed in periapical lesions：an immunohistochemicalstudy［J］.European Society of Endodontology，2005，38（5）：297-301.

［4］趙海霞，趙培培，吳小峰，等.短小芽孢桿菌膠原蛋白酶基因cola的克隆及序列分析［J］.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，29（4）：524-527.

［5］Eckhard U，Sch?nauer E，Ducka P，et al.Biochemical characterization of the catalytic domains of three different Clostridial collagenases［J］.Biological Chem istry，2009，390（1）：11-18.

［6］Teramura N，Tanaka K，Iijima K，etal.Cloning of anovel collagenasegene from the gram-negativebacterium Grimontia（Vibrio）hollisae1706Band Itsefficientexpression in Brevibacillus choshinensis［J］.Journalof Bacteriology，2011，193（12）：3049-3056.

［7］Janw itthayananW，Keelawat S，Payungporn S，etal.In vivo gene expression and immunoreactivity of Leptospira collagenase［J］. M icrobiological Research，2013，168（5）：268-272.

［8］X ie B B，Shu Y L，Qin Q L，etal.Genome sequencesof type strainsof seven speciesof themarine bacterium Pseudoalteromonas［J］.Journal of Bacteriology，2012，194（10）：2746-2747.

［9］Ballestriero F，Thomas T，Burke C，et al.Identification of compounds w ith bioactivity against the nematode Caenorhabditis elegans by a screen based on the functionalgenom ics of themarine bacterium Pseudoalteromonas tunicata D2［J］.Applied and Environmental M icrobiology，2010，76（17）：5710-5717.

［10］陳威，朱鵬，何山，等.海洋細(xì)菌Pseudoalteromonas sp.NJ631中NRPS基因簇及核心模件的發(fā)掘［J］.微生物學(xué)報，2012，52（12）：1531-1539.

［11］M cQuade T J，Shallop A D，Sheoran A，et al.A nonradioactive high-throughput assay for screening and characterization of adenylation domains fornonribosomalpeptide combinatorialbiosynthesis［J］.Analytical Biochem istry，2009，386（2）：244-250.

［12］Sung-IIKang S，Jang YB，Choi YJ，et al.Purification and properties of a collagenolytic protease produced by marine bacterium Vibrio vulnificus CYK279H［J］.Biotechnology and Bioprocess Engineering，2005，10：5935-5998.

［13］Rainbow L，W ilkinson M C，Sargent P J，et al.Identification and expression of a Burkholderia pseudomallei collagenase in Escherichia coli.［J］.Current M icrobiology，2004，48（4）：300-304.

Molecular Cloning and Expression of Collagenase Produce by Marine Bacteria Pseudoalteromonas sp. NJ631

XUEChunxu1，CHENWei2，ZHOU Yufang3，ZHU Peng*1
（1.SchoolofM arine SciencesNingbo University，Ningbo 315211，China；2.PingYang Ooceanic&Fishery Bureau，Wenzhou 325400，China；3.Zhejiang Marine Development Research Institute，Zhoushan 316100，China）

The gene encoding collagenase from Pseudoalteromonas sp.NJ631 was cloned and expressed in E.coli cells.Subsequently，the bioactivity of recombinant protein，named PNJC，was assessed.The gene sequence encoding a putative collagenase，designed Pnjc，was obtained from the genome of Pseudoalteromonas sp.NJ631 using a genomem ining approach.The Pnjc coding region was amplified and cloned into pET-28a Vector.The plasm ids harboring the assembled full-length sequence encoding PNJC were transformed into the E.coli cells for the expression of the PNJCprotein.The expression and purification of the recombinant protein were carried on according to manufacturer's instruction.Finally，the enzymatic activity of collagenase was assessed by using recombinant protein decomposing the type Icollagen as substrate.The 1359-bp open reading frame with 45.62%GC was obtained from the genome of Pseudoalteromonas sp.NJ631，which was encoded of a protein of 452 am ino acids and shared significanthomology with the collagenase from the other genera.The PNJC was highly expressed by adding 0.2 mM IPTG.The assay of enzyme activity showed that the enzyme activity of PNJC was 160.34 U/mg，70.48%of the standard，confirm ing that the Pnjc gene encoded a functional collagenase.This is the first reportof the cloning the expression of collagenase from marine bacteria Pseudoalteromonas sp.The PNJC encoded by Pnjc gene from NJ631 showed high bioactivity on decomposing the type I collagen，which are of potentialvalue for the commercialexploitation.

Pseudoalteromonas，collagenase，genomem ining，enzymatic activity

Q 819

A

1673—1689（2015）11—0000—07

2014-00-00