姚其玉，張梁*，石貴陽(yáng)，顧正華，丁重陽(yáng)

（1.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122；2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122）

楊氏檸檬酸桿菌磷脂酶A1基因在E.coli中的表達(dá)

姚其玉1，2，張梁*1，2，石貴陽(yáng)1，2，顧正華1，2，丁重陽(yáng)1，2

（1.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122；2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122）

為實(shí)現(xiàn)磷脂酶A1（PLA1）的異源表達(dá)，將楊氏檸檬酸桿菌（CICC No.21596）PLA1基因插入載體pET28a（+）中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a（+）-pla1，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌E.coli BL21（DE3）中，獲得重組菌pET28a（+）-pla1/DE3。在IPTG誘導(dǎo)作用下經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在重組菌發(fā)酵破碎上清液中存在33 000大小的蛋白質(zhì)，與預(yù)期蛋白質(zhì)大小相符。在硼砂卵黃平板上對(duì)重組菌PLA1活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示重組菌具有明顯的PLA1活性，表明PLA1基因在大腸桿菌中得到了表達(dá)。經(jīng)發(fā)酵初步優(yōu)化，獲得搖瓶發(fā)酵的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為：轉(zhuǎn)接體積分?jǐn)?shù)4%、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)2 h、IPTG終濃度為0.4 mmol/L、37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h。經(jīng)酸堿滴定法測(cè)得最高酶活為（5.6±0.2）U/mL。

楊氏檸檬酸桿菌；磷脂酶A1；表達(dá)；優(yōu)化；大腸桿菌

磷脂酶A1（phospholipaseA1，PLA1，EC3.1.1.32），是一類水解磷脂生成溶血性磷脂和自由脂肪酸的酶［1］。PLA1在工業(yè)上被廣泛應(yīng)用于油脂脫膠以及磷脂改性［2-4］，此外由其催化磷脂水解生成的溶血性磷脂在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域也具有極為廣泛的應(yīng)用［5-6］。PLA1的來(lái)源渠道比較狹窄，主要來(lái)自蛇的毒液和動(dòng)物胰臟，目前還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。目前已有篩選得到產(chǎn)PLA1菌株的報(bào)導(dǎo)［7-8］，但由于野生菌株產(chǎn)酶量往往較低且難以分離純化，并且存在一定的食品安全隱患，因此應(yīng)用野生菌株產(chǎn)酶的前景大大降低。而微生物來(lái)源的酶具有生產(chǎn)周期短、操作簡(jiǎn)單且可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，因此具有很大的應(yīng)用價(jià)值。目前已經(jīng)有PLA1基因在不同宿主菌中異源表達(dá)的報(bào)導(dǎo)，例如液化沙雷氏菌PLA1基因在大腸桿菌中的表達(dá)［9-10］以及米曲霉PLA1基因在釀酒酵母中的表達(dá)［11］，但酶活力普遍較低。作者以楊氏檸檬酸桿菌為出發(fā)菌株，利用基因工程技術(shù)，將PLA1基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，以期實(shí)現(xiàn)PLA1的異源表達(dá)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒菌種Citrobacter youngae：保藏于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心（CICCNo.21596）；E.coli JM109、BL21（DE3）菌株及載體pET28a（+）：均為作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2試劑限制性內(nèi)切酶Bam H I、Hind III、DNA marker、Proteinmarker：購(gòu)自寶生物（大連）工程有限公司；T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、pMD19-T（Simple）載體：購(gòu)自TaKaRa公司；DNA片段純化試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒：均購(gòu)自北京博大泰克生物技術(shù)公司；50%卵黃：購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

下游引物P2

上述引物由上海生工技術(shù)有限公司合成。

1.1.4培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基：l g/dL胰蛋白胨、0.5 g/dL酵母提取物、l g/dLNaCl，并調(diào)節(jié)pH至7.0。制備固體培養(yǎng)基則加入1.5 g/dL瓊脂。

硼砂卵黃固體培養(yǎng)基：NaCl 0.66 g/dL、硼酸1.09 g/dL、硼砂0.19 g/dL、瓊脂1.5 g/dL、卵黃2 g/dL，pH 7.2～7.4。

1.2方法

1.2.1楊氏檸檬酸桿菌pla1基因的獲取Citrobacter youngae染色體DNA的提取操作按照文獻(xiàn)［12］進(jìn)行。根據(jù)NCBI上報(bào)導(dǎo)的Citrobacter youngae ATCC 29220 PLA1基因序列設(shè)計(jì)引物P1及P2，利用引物P1及P2以楊氏檸檬酸桿菌染色體為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃30 s、57℃1 min、72℃1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，并用純化試劑盒純化。

1.2.2重組質(zhì)粒pMD19T-pla1的構(gòu)建將純化回收的目的基因片段與pMD19-T（Simple）連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，并涂布氨芐LB抗性平板，挑取轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至含氨芐的LB培養(yǎng)基中，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒并用Bam H I和Hind III酶切驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送到上海生工進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pMD19T-pla1。

1.2.3表達(dá)重組質(zhì)粒pET28a-pla1的構(gòu)建提取重組菌pMD19T-pla1/JM109的質(zhì)粒，用Bam H I和Hind III酶切，割膠回收目的片段，與同樣經(jīng)Bam H I和Hind III酶切線性化的pET28a（+）載體16℃過(guò)夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109中，并涂布卡那霉素抗性平板，37℃培養(yǎng)10 h，挑取轉(zhuǎn)化子接種至卡那霉素LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h，提質(zhì)粒并用Bam H I和Hind III雙酶切驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子命名為pET28a（+）-pla1。

1.2.4重組PLA1工程菌的構(gòu)建提取pET28a（+）-pla1/JM109的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DE3，并涂布卡那霉素抗性平板進(jìn)行篩選。

1.2.5重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析接種重組菌pET28a（+）-pla1/DE3以及pET28a（+）/ DE3于LB卡那霉素培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，第二天以4%的接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接至50 mL LB卡那霉素培養(yǎng)基中，當(dāng)OD600為0.6～0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L，37℃誘導(dǎo)6 h。誘導(dǎo)結(jié)束后離心收集菌體，用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液重懸菌體進(jìn)行超聲波破碎，將破碎液12 000 r/min離心20 min，取上清液用10 g/dL的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳。1.2.6 PLA1酶活力的測(cè)定采用硼砂卵黃平板法［10］和酸堿滴定法［13-14］進(jìn)行酶活力測(cè)定。

1.2.7重組菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定接種大腸桿菌重組菌于20 mL含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，以4%的接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接至50 mL含卡納霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)，定時(shí)取樣并測(cè)OD600值。

1.2.8誘導(dǎo)條件的優(yōu)化研究誘導(dǎo)劑加入時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度以及誘導(dǎo)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響。

2　結(jié)果與分析

2.1PLA1基因擴(kuò)增及pMD19T-pla1的構(gòu)建

楊氏檸檬酸桿菌PLA1基因的大小為870 bp，所設(shè)計(jì)引物P1及P2之間的片段大小為986 bp，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳后，可在1 000 bp附近看到清晰的目的條帶，見(jiàn)圖1，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符。與pMD19-T（Simple）連接后用Bam H I和Hind III雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖2。出現(xiàn)986 bp和2692 bp兩條帶，分別對(duì)應(yīng)目的基因片段和載體大小。挑取驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子送上海生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，擴(kuò)增序列與ATCC29220的PLA1基因序列比對(duì)相似度為90.11%。

2.2重組質(zhì)粒pET28a（+）-pla1的構(gòu)建

將所構(gòu)建的pET28a（+）-pla1重組質(zhì)粒用Bam H I和Hind III酶切后得到pET28a（+）和PLA1基因兩個(gè)片段，大小分別為5 369 bp和986 bp，結(jié)果見(jiàn)圖3，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1　目的基因PCR擴(kuò)增Fig.1　Product of PCR am plification

圖2　重組表達(dá)載體pMD19-pla1的酶切鑒定Fig.2　Identification of recombinant expression vector pMD 19-pla1 by enzym e digesion

圖3　重組表達(dá)載體pM D19-pla1的酶切鑒定Fig.3　Identification of recombinant expression vector pET28a-pla1 by enzyme digesion

2.3SDS-PAGE電泳結(jié)果

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET28a（+）-pla1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子酶切驗(yàn)證，獲得重組菌pET28a（+）-pla1/DE3。接種重組菌pET28a（+）-pla1/DE3，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，離心收集菌體并超聲波破碎后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果見(jiàn)圖4。在33 000處有明顯蛋白質(zhì)條帶，初步說(shuō)明PLA1基因在大腸桿菌中得到了表達(dá)。

圖4　重組菌表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.4　SDS-PAGE of expressedt protin

2.4重組菌酶活力檢測(cè)

接種pET28a（+）-pla1/DE3和pET28a（+）/DE3，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后離心收集菌體并超聲波破碎。將獲得的破碎液于12 000 r/min離心20min，各取100 μL點(diǎn)到放置有牛津杯的硼砂卵黃平板上，37℃放置8 h觀察酶活力情況，其結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖5可以看出，重組菌pET28a（+）-pla1/DE3破碎液在卵黃平板上可產(chǎn)生明顯的白色暈圈，而其對(duì)照pET28a（+）/DE3并沒(méi)有產(chǎn)生暈圈，說(shuō)明PLA1在重組菌中得到了表達(dá)。

圖5　重組菌磷脂酶A1活力檢測(cè)Fig.5 Detetion of the recombinan t E.coli PLA1 activity

2.5重組菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

通過(guò)測(cè)定重組菌的生長(zhǎng)曲線可清楚地分析重組菌的生長(zhǎng)狀態(tài)，從而可以更好地確定誘導(dǎo)劑加入的時(shí)機(jī)，生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖6。從圖6可以看出，重組菌接種后的0～1 h為延滯期，1～6 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，之后進(jìn)入穩(wěn)定期。

圖6　重組菌pET28a-pla1/DE3生長(zhǎng)曲線Fig.6 Grow th curve of recombinant strains pET28apla1/DE3

2.6重組菌誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

2.6.1誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)酶活力的影響分別選取重組菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期不同時(shí)間段添加誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)，研究其對(duì)產(chǎn)酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。在菌體轉(zhuǎn)接2 h后，誘導(dǎo)所產(chǎn)酶活力最高。誘導(dǎo)劑加入的時(shí)間過(guò)早，會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶能力；誘導(dǎo)劑加入時(shí)間過(guò)晚，細(xì)胞活力會(huì)降低，從而影響重組菌的表達(dá)。

圖7　誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of induction initial time on PLA1 production

2.6.2誘導(dǎo)溫度對(duì)酶活力的影響大腸桿菌的最適生長(zhǎng)溫度為37℃，最佳誘導(dǎo)溫度隨產(chǎn)物不同而異。一般來(lái)說(shuō)，在25～37℃誘導(dǎo)表達(dá)，外源蛋白易于以活性狀態(tài)存在；37℃以上誘導(dǎo)，則易形成包涵體［15-16］。因此作者選取25、30、37℃三個(gè)溫度研究溫度對(duì)產(chǎn)酶水平的影響，結(jié)果見(jiàn)圖8。隨著誘導(dǎo)溫度的升高，酶活力也隨之升高，在37℃時(shí)酶活達(dá)到最高，因此選取最佳誘導(dǎo)溫度為37℃。

圖8　誘導(dǎo)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effectof induction tem peratureon PLA1 production

2.6.3誘導(dǎo)劑濃度對(duì)酶活力的影響IPTG是一種作用極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑，但高濃度IPTG對(duì)重組菌的生長(zhǎng)具有抑制作用，再加上IPTG本身價(jià)格昂貴，因此選擇一個(gè)合適的IPTG的濃度是非常必要的。為研究IPTG濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響，作者選取0.1～0.6 mmol/L之間6個(gè)不同IPTG濃度對(duì)重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。由圖9可以看出，IPTG濃度對(duì)產(chǎn)酶水平影響不是很大，在IPTG濃度為0.4 mmol/L時(shí)酶活力最大，因此確定該重組菌的最適IPTG濃度為0.4mmol/L。

圖9　IPTG濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effect of IPTG concentration on PLA1 p roduction

2.6.4誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)酶活力的影響分別選擇誘導(dǎo)時(shí)間2、4、6、8、10、12 h，研究其對(duì)菌體產(chǎn)酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖10。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力不斷上升，在8 h時(shí)酶活力達(dá)到最高值，之后酶活力稍有下降。

綜上所述，在IPTG的添加終濃度為0.4mmol/L，誘導(dǎo)溫度37℃、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為接種后2 h、誘導(dǎo)時(shí)間8 h時(shí)，大腸桿菌重組菌產(chǎn)PLA1水平達(dá)到最高，通過(guò)酸堿滴定法測(cè)得最高酶活力為（5.6±0.2）U/mL。

圖10　誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.10 Effect of induction time on PLA1 production

3　結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，隨著PLA1的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，國(guó)內(nèi)外關(guān)對(duì)于PLA1的研究也在不斷增加，但關(guān)于PLA1異源表達(dá)的報(bào)導(dǎo)仍然很少。目前PLA1異源表達(dá)的宿主菌主要是大腸桿菌，1988年Givskov［9］等從Serratia liquefaciens中獲得了PLA1基因，并在大腸桿菌中得到了表達(dá)，最高酶活力達(dá)到1 U/mL；1999年Jae Kwag［10］等從Serratia sp.MK1中獲得了PLA1基因，并在大腸桿菌中表達(dá)；2007年國(guó)內(nèi)付建紅［17］等從新疆天山一號(hào)冰川凍土中篩選到一種產(chǎn)低溫堿性磷脂酶A1的耐冷居全沙雷氏菌Serratia sp. xjF1，并將提取該菌的磷脂酶A1基因在大腸桿菌中表達(dá)，最高酶活力可達(dá)4.3 U/mL。以上在大腸桿菌表達(dá)的PLA1基因的來(lái)源菌均是液化沙雷氏菌屬，目前其它菌來(lái)源的PLA1基因在大腸桿菌的表達(dá)研究還很少，本研究首次實(shí)現(xiàn)了楊氏檸檬酸桿菌來(lái)源的PLA1基因在大腸桿菌的表達(dá)，對(duì)于研究PLA1生產(chǎn)菌株具有一定的指導(dǎo)意義。

作者成功克隆了楊氏檸檬酸桿菌PLA1基因，通過(guò)載體pET28a（+），成功構(gòu)建了表達(dá)PLA1的工程化大腸桿菌。通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間以及誘導(dǎo)溫度對(duì)PLA1酶活力影響的研究，得到了該工程菌的最佳誘導(dǎo)發(fā)酵條件。在最佳誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)該工程菌，最高酶活力可達(dá)到（5.6±0.2）U/mL。該重組菌產(chǎn)生的PLA1重組蛋白質(zhì)的C端具有HIS融合標(biāo)簽，為其下游的分離純化提供了方便。后續(xù)工作將利用C端的HIS融合標(biāo)簽對(duì)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化，以研究該P(yáng)LA1的酶學(xué)性質(zhì)，并將該P(yáng)LA1基因在枯草芽孢桿菌、畢赤酵母以及乳酸克魯維酵母等更加優(yōu)越安全的表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，以期獲得產(chǎn)量更高且更加安全的PLA1活性蛋白質(zhì)。

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Molecular Clone and Expression of Phospholipase A1 Gene from Citrobacter youngae in Escherichia coli

YAOQiyu1，2，ZHANG Liang*1，2，SHIGuiyang1，2，GU Zhenghua1，2，DINGChongyang1，2
（1.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，W uxi 214122，China；2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology of M inistry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

For theheterologousexpression of phospholipase A1，the gene of phospholipase A1 from Citrobacter youngae（CICC No.21596）was cloned into the expression vector pET28a（+）to construct the recombinant plasm id pET28a（+）-pla1.Then the recombinant plasm id was transformed into E.coli BL21（DE3）to achieve the recombinantstrain pET28a（+）-pla1/DE3.A fter subsequent induction by isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside（IPTG），an approximately 33 000 proteinwas detected in the cell lysate supernatantby SDS-PAGE.The PLA1 activitywasdetected in an egg yolk agar plate，indicating that the PLA1 gene was expressed in E.coli.The best induction conditions for PLA1 expression were achieved by the optim ization of fermentation condition and itwas showed as follows，4%of inoculum amount，2 h of initial culture，8 h of induced culture in the presence of 0.4mmol/L of IPTG，and grow th at37℃.Under theoptim ized conditions，themaximum PLA1 activity in the supernatantwas（5.6±0.2）U/m L.

Citrobacter youngae，phospholipase A1，expression，optim ization，E.coli

Q 786

A

1673—1689（2015）11—1172—06

2014-03-04

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目（2011AA100905）；江蘇省“六大人才高峰”高層次人才項(xiàng)目（2012-NY-002）；江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自由探索項(xiàng)目（SKLF-ZZA-201201）。

張梁（1978—），男，江蘇無(wú)錫人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事工業(yè)微生物、酶工程技術(shù)方面的研究。

E-mail：zhangl@jiangnan.edu.cn