張嬋娟　成羿　董學(xué)亮

輕揉推拿法對(duì)兔骨骼肌急性鈍挫傷后肌球蛋白重鏈和膠原表達(dá)的影響

張嬋娟成羿董學(xué)亮

目的 通過(guò)應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)分析內(nèi)源性Ⅱb型肌球蛋白重鏈及Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)來(lái)探討輕柔推拿法對(duì)骨骼肌鈍挫傷修復(fù)的作用及其可能機(jī)制。方法 27只實(shí)驗(yàn)兔中24只實(shí)施后腿腓腸肌自由落體致傷，建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃蠓譃橥颇媒M、外傷對(duì)照組，每組12只，另取3只作為正常對(duì)照組。采用“重物自由落體致傷法”制作大白兔骨骼肌急性鈍挫傷模型。分別在3d、10d、20d、27d處死大白兔，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死3只兔子，每只兔子在兩條后腿腓腸肌取標(biāo)本，共計(jì)6個(gè)標(biāo)本。結(jié)果 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)內(nèi)源性Ⅱb型主要組織相容性復(fù)合體（MHC）mRNA，第3天推拿組與外傷組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），第10天推拿組與外傷組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），第20天、27天推拿組表達(dá)量比外傷組表達(dá)高（P＜0.05）。RT-PCR技術(shù)檢測(cè)內(nèi)源性I型膠原mRNA的表達(dá)量：第3天、10天外傷組與推拿組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。第20天推拿組表達(dá)量低于外傷組（P＜0.05）。RT-PCR技術(shù)檢測(cè)內(nèi)源性Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)量：第3天推拿組與外傷組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），第10天、20天、27天推拿組表達(dá)量低于外傷組（P＜0.05）。結(jié)論 輕揉推拿法在骨骼肌急性鈍挫傷修復(fù)中晚期能有效促進(jìn)Ⅱb型MHC內(nèi)源性mRNA表達(dá)升高，從而促進(jìn)新骨骼肌生成。輕揉推拿法在骨骼肌急性鈍挫傷修復(fù)中晚期能有效降低I及Ⅲ型膠原內(nèi)源性mRNA過(guò)高表達(dá)，從而減緩骨骼肌內(nèi)纖維化過(guò)程的發(fā)生，改善骨骼肌愈合質(zhì)量。

輕柔推拿法 骨骼肌 Ⅱb型MHC I型膠原 Ⅲ型膠原

傳統(tǒng)的中醫(yī)推拿治療骨骼肌損傷有著獨(dú)特的療效，如何采用實(shí)驗(yàn)研究支持和詮釋臨床療效。本實(shí)驗(yàn)是模仿臨床中醫(yī)推拿療法，對(duì)兔子腓腸肌鈍挫傷進(jìn)行的治療研究，通過(guò)應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對(duì)Ⅱb型主要組織相容性復(fù)合體（MHC）、I 型膠原、Ⅲ 型膠原mRNA的測(cè)定，來(lái)了解推拿療法對(duì)骨骼肌損傷修復(fù)的進(jìn)程和質(zhì)量，探討推拿療法對(duì)骨骼肌修復(fù)的可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物與儀器 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：中國(guó)大白兔27只，平均體重（2.5±0.2）kg，雌雄各半，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。飼養(yǎng)及取標(biāo)本皆在該中心完成。（2）主要儀器：Quantity One全自動(dòng)凝膠圖象分析系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國(guó)）。eppendorf centrifuge 5418高速離心機(jī)（德國(guó)）。HITACHI H-7650透射電鏡（日本電子公司）。BioRad-iCycler M367999型 PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）。美國(guó)Labnet Gel XL Ultra V-2電泳儀（上海）。Quantity One凝膠圖象處理系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國(guó)）。Nanodrop ND-1000，ND-2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀（北京）。Heraeus高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)）。DK-8D型 電熱恒溫水槽（上海）。AEL-200電子天平（日本島津公司）。（3）實(shí)驗(yàn)材料：兔解剖臺(tái)、電動(dòng)剃毛刀、自制1m高木架臺(tái)、3m卷尺、1000g打擊棒（直徑2cm）、塑料管（直徑2.2cm）。

1.2分組與造模 27只實(shí)驗(yàn)兔中24只實(shí)施后腿腓腸肌自由落體致傷，建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃蠓譃橥颇媒M和外傷對(duì)照組，每組12只，另取3只作為正常對(duì)照組。依據(jù)觀察的時(shí)間點(diǎn)，推拿組和外傷對(duì)照組再分為4小組，每組3只。參照張靜等［1］的模型，并稍加改進(jìn)。造模過(guò)程：將日本大耳白兔俯臥位固定在解剖臺(tái)上，在雙后肢褪毛，利用重力棒選定腓腸肌肌腹中段作為落體擊落目標(biāo)（距跟骨6.5cm處）。將打擊棒放于塑料管中，管下口垂直對(duì)準(zhǔn)打擊部位，重物自由落體下落導(dǎo)致一次打擊傷，造成腓腸肌急性挫傷模型。打擊物重1000g，下落高度50cm，重力為9.8N，動(dòng)能為4.9J，打擊面積約3.14cm2。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理 造模成功后分別在第3、10、20、27天處死實(shí)驗(yàn)兔取標(biāo)本。推拿組：傷后第3天開(kāi)始推拿，10～20min/d。推拿方法：在兔小腿三頭肌處采用化瘀止痛輕揉手法。先用輕推法，以大拇指指端著力于跟腱，向腘窩方向進(jìn)行直線推移。頻率20次/ min，持續(xù)5min。再用拇指揉法，持續(xù)5min，頻率為60～80次/min。最后用擦法，即用手掌的大魚(yú)際做跟腱與腘窩間的來(lái)回摩擦，頻率80～100次/min，持續(xù)5min。外傷對(duì)照組：僅予紗布包扎傷處。

1.4觀察指標(biāo) 在動(dòng)物損傷后第3、10、20、27天，采用3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注入（40mg/kg）將實(shí)驗(yàn)兔麻醉后取下雙側(cè)腓腸肌損傷區(qū)域肌肉，貯于-80℃冰箱保存。采用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）分析Ⅱb型MHC、I型及Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)。

1.5引物設(shè)計(jì)與合成 檢索 NCB I GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中Ⅱb型MHC、I型膠原、Ⅲ型膠原全長(zhǎng) mRNA序列，應(yīng)用PrimerⅡ premier5.0軟件設(shè)計(jì)出Ⅱb型MHC、I型膠原、Ⅲ型膠基因以及內(nèi)參GAPDH基因的上下游引物序列。引物均由TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，三組的組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1推拿對(duì)修復(fù)過(guò)程中骨骼?、騜型MHC蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)表1。

表1?、騜型MHC的mRNA含量同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)比較（x±s）

2.2推拿對(duì)修復(fù)過(guò)程中骨骼肌Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)表2。

表2?、裥湍z原的mRNA含量同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)比較（x±s）

2.3推拿對(duì)修復(fù)過(guò)程中骨骼?、笮湍z原蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)表3。

表3?、笮湍z原的mRNA含量同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)比較（x±s）

3　討論

在日常生活、施工建設(shè)、交通事故和競(jìng)技運(yùn)動(dòng)中，骨骼肌損傷是常見(jiàn)多發(fā)病。骨骼肌損傷恢復(fù)時(shí)間長(zhǎng)，愈合質(zhì)量不可靠，容易反復(fù)再傷，延續(xù)數(shù)年，直至肌肉變性和瘢痕形成。長(zhǎng)期疼痛和肌肉彈性減弱可影響日常生活，運(yùn)動(dòng)員因此而喪失運(yùn)動(dòng)能力。推拿是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分，也是中醫(yī)的一大特色，其基本功效在于活血化瘀、通絡(luò)舒筋、消腫止痛，從而使氣行則血行，血活則瘀去，瘀去則生新，損傷的組織即可得到修復(fù)。推拿治療骨骼肌損傷臨床上具有顯著療效，故該治療方法應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)員更具優(yōu)勢(shì)。

骨骼肌挫傷修復(fù)表現(xiàn)為一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，這個(gè)過(guò)程反映了組織對(duì)于創(chuàng)傷以及鍛煉等各種超負(fù)荷狀態(tài)的適應(yīng)能力。所有這些情況導(dǎo)致了一系列病理變化的發(fā)生，包括肌纖維再生和膠原合成。創(chuàng)傷的反應(yīng)過(guò)程是有規(guī)律的，調(diào)節(jié)和控制這一系列過(guò)程的分子機(jī)制已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。骨骼肌挫傷修復(fù)所表現(xiàn)的肌纖維壞死凋亡和再生及膠原合成，這兩個(gè)過(guò)程相互支持同時(shí)又相互競(jìng)爭(zhēng)制約，共同影響骨骼肌挫傷后修復(fù)的質(zhì)量［2］。骨骼肌損傷會(huì)累及肌纖維、間質(zhì)連接組織及血管。斷裂的肌纖維向兩端收縮而使肌纖維殘端之間出現(xiàn)腔隙，該腔隙較快被血腫填充。血腫又逐漸被增殖的成纖維細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)成分所取代，以保證連接組織的完整性，此過(guò)程是瘢痕形成的過(guò)程。同時(shí)，骨骼肌細(xì)胞也進(jìn)行增殖而企圖將兩殘端連接起來(lái)，此過(guò)程是骨骼肌再生的過(guò)程。以往資料多從挫傷肌肉形態(tài)結(jié)構(gòu)變化、有氧代謝酶活性、血液中致痛物質(zhì)變化方面探討治療肌肉損傷的作用機(jī)制，不能充分反映骨骼肌挫傷后愈合的過(guò)程和質(zhì)量，且推拿對(duì)骨骼肌損傷治療作用的基礎(chǔ)研究較少。本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR技術(shù)，觀察骨骼肌鈍挫傷后推拿對(duì)骨骼肌挫傷修復(fù)過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)成肌標(biāo)志物及瘢痕形成標(biāo)志物表達(dá)的影響，可了解骨骼肌損傷治療后，成肌細(xì)胞增生、肌球蛋白變化和瘢痕組織形成情況，從而判斷推拿在促進(jìn)骨骼肌功能性恢復(fù)，減少瘢痕組織，優(yōu)化骨骼肌收縮結(jié)構(gòu)功能方面的作用。探討推拿手法促進(jìn)骨骼肌鈍挫傷愈合的療效和可能機(jī)制。

肌球蛋白重鏈?zhǔn)枪趋兰±w維中最重要的肌原纖維蛋白之一。其使肌纖維收縮產(chǎn)生能量，含有與肌肉收縮速度有關(guān)的酶活性，維持肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。在嚙齒動(dòng)物中已證實(shí)了幾種成年型肌球蛋白的異構(gòu)體：Ⅰ型MHC存在于Ⅰ型慢肌纖維中，Ⅱa、Ⅱx、Ⅱb型MHC分別存在于ⅡA、ⅡX、ⅡB型快肌纖維中。肌肉中的MHC類型對(duì)肌肉生理至關(guān)重要。而膠原作為肌細(xì)胞外成分之一，是結(jié)締組織的主要蛋白成分，在細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)育以及整個(gè)生命周期中起著重要作用［3，4］。依據(jù)分子組成的不同，目前發(fā)現(xiàn)的膠原至少有15種類型。Ⅰ型膠原主要存在于骨、肌腱、牙釉質(zhì)及皮膚中；Ⅲ型膠原主要存在于皮膚、血管、子宮內(nèi)膜等組織發(fā)生的早期；有些組織中Ⅰ型與Ⅲ型膠原可同時(shí)存在，如骨骼肌組織同時(shí)含有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型膠原，其中Ⅰ、Ⅲ 型膠原含量最豐富。正常骨骼肌的Ⅰ型與Ⅲ 型膠原主要位于肌內(nèi)膜與肌束膜處，Ⅰ型膠原形成致密的長(zhǎng)束狀，而Ⅲ型膠原形成疏松的網(wǎng)狀，故彈性與抗應(yīng)力性均較好。完全由Ⅰ型膠原組成的組織（如肌腱組織）則幾乎無(wú)彈性［5，6］。在骨骼肌組織中，膠原作為其組織連接的主要結(jié)構(gòu)成分具有重要功能：其形成原纖維使骨骼肌細(xì)胞彼此相連，也使骨骼肌細(xì)胞與肌腱、筋膜組織相連接；另外，其對(duì)肌肉細(xì)胞、毛細(xì)血管及神經(jīng)有支持作用，還與肌肉的機(jī)械性質(zhì)及粘彈性有關(guān)。因此，Ⅱb型肌球蛋白重鏈及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白是骨骼肌損傷后修復(fù)研究中極有價(jià)值的指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示推拿能有效促進(jìn)骨骼肌再生，與外傷對(duì)照組比較，在骨骼肌損傷的中晚期其能使MHC-Ⅱb mRNA 表達(dá)水平明顯提高（P＜0.05）。同時(shí)還顯示推拿治療后，骨骼肌修復(fù)組織的Collagen-Ⅲ與Collagen-I 的 mRNA 表達(dá)水平升幅比外傷對(duì)照組低，提示該治療方法亦能減緩纖維化過(guò)程的發(fā)生。作者認(rèn)為推拿能抑制膠原的表達(dá)可能是通過(guò)促進(jìn)肌細(xì)胞大量再生而抑制了瘢痕組織的形成有關(guān)，也許還存在其它機(jī)制，有待進(jìn)一步的探討。

推拿能促進(jìn)骨骼肌鈍挫傷后的肌肉再生和抑制瘢痕組織的形成，這似乎有利于骨骼肌組織的功能修復(fù)。作者的前期工作已經(jīng)表明，推拿可以促進(jìn)骨骼肌損傷后肌肉形態(tài)與結(jié)構(gòu)的恢復(fù)。但是，由于組織功能的執(zhí)行者是蛋白質(zhì)，而從 mRNA 到蛋白質(zhì)還需要一個(gè)翻譯的過(guò)程。因此，作者還需了解 MHC-Ⅱb、Collagen-Ⅲ 及 Collagen-I 在骨骼肌鈍挫傷修復(fù)過(guò)程中蛋白水平及其它相關(guān)指標(biāo)，對(duì)推拿在骨骼肌損傷后修復(fù)過(guò)程中的作用才能作進(jìn)一步的了解和客觀評(píng)價(jià)。

1張靜，趙斌.按摩對(duì)兔骨骼肌挫傷后修復(fù)作用的研究.河北師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，15（1）：106.

2朱文輝，陳世益.肌球蛋白重鏈及I、Ⅲ 型膠原在骨骼肌損傷修復(fù)中的作用.中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2002，21（2）：179～182.

3Guillermo H. Graziotti， Clara M. Ríos，José-Luis L. Evidence for Three Fast Myosin Heavy Chain Isoforms in Type Ⅱ Skeletal Muscle Fibers in the Adult Llama. Journal of Histochemistry & Cytochemist ry，2001，49：1033～1044.

4Devor ST， White TP. Myosin heavy chain phenotype in regenerating skeletal muscle is affected by thyroid hormone. Med Sci Sports Exerc，1995，27（5）：674～681.

5Ellen M. Arruda， Kevin Mundy， Sarah Calve， et al. Denervation does not change the ratio of collagen I and collagen Ⅲ mRNA in the extracellular matrix of muscle. Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol，2007，292： R983～R987.

6K. M. Heinemeier，J. L. Olesen，F(xiàn). Haddad，et al. Effect of unloading followed by reloading on expression of collagen and related growth factors in rat tendon and muscle.J Appl Physiol，2009，106（1）： 178～186.

Objective To study the function of massage in recovery from blunt skeletal muscular contusion and its possible mechanism by using reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） technology to detect the endogenous Ⅱb MHC，I and Ⅲ collagen mRNA expression. Method 27 rabbits were randomly divided into the massage group，the trauma comparison group，each with 12 rabbits，and the normal comparison group with the other 3 rabbits. The model of the rabbits’ acute blunt skeletal muscular contusion is made by using the “blow of heavy weight free falling”. Three rabbits from each group were put to death at each time point on the 3rd day，the 10th day，the 20th day and the 27th day，with two hind gastrocnemius muscles of each rabbit taken as specimens，6 specimens in total each time. Results By using the RT-PCR technology to detect endogenous Ⅱb MHC mRNA，it showed no statistical significance to compare the massage group on the 3rd day with the trauma comparison group； it was statistically rewarding to compare the massage group with the trauma comparison group on the 10th day （P＜0.05）. Besides，the expression levels of the massage group on the 20th and 27th days were higher than those of the trauma comparison group，which was statistically rewarding （P＜0.05）. By using the RT-PCR technology to detect the expression level of endogenous I collagen mRNA，it was not rewarding statistically to compare the trauma comparison group with the massage group on the 3rd and 10th days. The expression level of the massage group on the 20th day was lower than that of the trauma comparison group （P＜0.05）. By using the RT-PCR technology to detect the expression level of endogenous Ⅲ collagen mRNA，it was not rewarding statistically to compare the massage group with the trauma comparison group on the 3rd day. The expression levels of the massage group on the 10th，20th and 27th days were lower than those of the trauma comparison group （P＜0.05）.Conclusions Firstly，the massage at the intermediate and late stages of the acute blunt skeletal muscle contusion can effectively raise the Ⅱb MHC endogenous mRNA expression. Secondly，massage at the intermediate and late stages of the recovery of acute blunt skeletal muscle contusion can effectively reduce the over-expression of I，Ⅲ collagen endogenous mRNA，thus improving the healing quality of skeletal muscles.

The effects of gentle massage Skeletal muscle Ⅱb MHC I collagen Ⅲ collagen

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009C33100）

310007 杭州市中醫(yī)院