丁勇

（陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，西安陜西710021）

海紅果酒中白藜蘆醇及其糖苷的檢測(cè)方法研究

丁勇

（陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，西安陜西710021）

建立一種基于反相液相色譜檢測(cè)海紅果酒中白藜蘆醇及其糖苷的分析方法。研究海紅果酒預(yù)處理?xiàng)l件及高效液相色譜條件，確定最佳預(yù)處理方法為殼聚糖脫色，再采用甲酸乙酯為萃取劑在4℃、pH 2處理脫色后樣品。高效液相色譜條件為乙腈和水作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，在波長(zhǎng)306 nm條件下檢測(cè)反式白藜蘆醇及反式白藜蘆醇苷。結(jié)果顯示白藜蘆醇及其糖苷的加樣回收率為98.6%～104.2%，基線(xiàn)平穩(wěn)，精密度好，適合對(duì)海紅果酒中的白藜蘆醇及其糖苷的定量分析。

海紅果酒；白藜蘆醇；白藜蘆醇苷；高效液相色譜

海紅果是薔薇科植物海紅樹(shù)的果實(shí)，是我國(guó)稀有果樹(shù)資源，主要產(chǎn)區(qū)為陜西省府谷縣。海紅果含糖量在10%～15%，滴定酸含量在1%左右，同時(shí)含有大量的維生素、多酚類(lèi)化合物、微量元素，其果汁酸甜適口、風(fēng)味獨(dú)特適合釀造果酒。白藜蘆醇屬多酚類(lèi)化合物，在植物內(nèi)主要以白藜蘆醇及其糖苷的形式存在，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗心血管疾病、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老等作用［1-6］。目前，葡萄酒中白藜蘆醇的分析主要利用高效液相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用、毛細(xì)管電泳法等手段，采用直接進(jìn)樣快速分析的方法［7-8］。海紅果酒（樣品為企業(yè)委托開(kāi)發(fā)的成品果酒）具有單寧、黃酮類(lèi)化合物含量高，色澤深，白藜蘆醇含量低的特點(diǎn)，采用類(lèi)似葡萄酒中白藜蘆醇直接進(jìn)樣的高效液相色譜檢測(cè)，基線(xiàn)背景噪聲大、出峰多，為提高色譜柱的分辨率和使用壽命，本試驗(yàn)主要研究樣品的預(yù)處理方法及高效液相色譜條件，建立適合海紅果酒的白藜蘆醇及其糖苷的檢測(cè)方法。

1材料與方法

1.1樣品

海紅果酒。

1.2主要儀器

WATERS 1525型高效液相色譜儀；WATERS 2487 Dual λ型紫外檢測(cè)器；EMPOWER化學(xué)工作站；UPHW-IZ-90T純水制造系統(tǒng)；RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；TG16-WS高速臺(tái)式離心機(jī)。

1.3試劑

色譜純乙腈（滬試）；超純水；反式白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品（沃凱，純度≥99%）；反式白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)品（沃凱，純度≥99%）；色譜純甲醇（滬試）；甲酸乙酯（滬試，分析純）；乙酸乙酯（滬試，分析純）；丁酸乙酯（滬試，分析純）。

1.4色譜條件

色譜柱：Diamonsil（C18 5μm 250mm×4.6mm），配有C18保護(hù)柱；流動(dòng)相：A為乙腈，B為水；柱溫：室溫；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：306 nm［9-12］。

1.5試驗(yàn)方法

取適量海紅果酒，經(jīng)脫色、過(guò)濾后，用2 mol/L的鹽酸調(diào)整pH，精確移取不同pH的海紅果酒樣品至分液漏斗中，用等體積甲酸乙酯、乙酸乙酯、正丁酸乙酯萃取3次，萃取時(shí)間為20 min，有機(jī)相、水相、乳化層分開(kāi)收集，乳化層在4 000 r/min離心15 min分離有機(jī)相和水相，合并有機(jī)相。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀低溫蒸發(fā)，殘留物用50%甲醇水溶液溶解，0.45 μm油膜過(guò)濾，濾液超聲脫氣10 min，按1.4所述的色譜條件進(jìn)行定量檢測(cè)。1.6脫色率

在波長(zhǎng)440 nm下測(cè)定樣品的透光率，脫色率為

式中：A0為脫色前樣品的吸光度；A1為脫色后樣品的吸光度。

2結(jié)果與分析

2.1條件優(yōu)化

2.1.1脫色

海紅果酒色澤呈深棕褐色，且單寧含量高，通過(guò)澄清、脫色后才能進(jìn)行高效液相色譜分析。超濾澄清效果較好，但脫色效果差，因此采用吸附劑吸附脫色效果較好。試驗(yàn)選擇了活性炭及殼聚糖作為脫色劑，考察了不同處理?xiàng)l件的脫色效果如圖1、圖2所示。

圖1　活性炭不同處理?xiàng)l件對(duì)海紅果酒脫色的影響Fig.1The influence of different processing conditions of activated carbon on decolorizing of circassian fruit wine

圖2　殼聚糖不同處理?xiàng)l件對(duì)海紅果酒脫色的影響Fig.2The influence of different processing conditions of chitosan on decolorizing of circassian fruit wine

活性炭脫色效果隨溫度的升高快速增加，溫度在50℃以?xún)?nèi)，脫色效果差，脫色率低；適宜的脫色溫度在60℃以上，用量在0.12 g/100 mL酒液時(shí)，脫色率低于80%。殼聚糖脫色溫度低，脫色率在90%以上。綜合考慮白藜蘆醇的穩(wěn)定性及脫色率，采用35℃、果酒自然pH、每100 mL果酒添加2.5 g殼聚糖的條件，在此條件下，脫色率達(dá)到92.6%，效果最佳。

2.1.2萃取劑的選擇

萃取劑使用甲酸乙酯、乙酸乙酯、正丁酸乙酯，進(jìn)行液液萃取，經(jīng)HPLC定量分析，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3　不同萃取劑對(duì)白藜蘆醇及其糖苷萃取效果Fig.3Chromatograms of different extraction agents on the effect of resveratrol and its glucoside extracted standard of resveratrol and piceid

甲酸乙酯的萃取效果最好，提取率高，雜質(zhì)峰干擾少，主要原因可能是白藜蘆醇屬非黃酮類(lèi)的多酚化合物，易溶于有機(jī)溶劑，而黃酮苷類(lèi)化合物易溶于水，通過(guò)有機(jī)溶劑萃取以與干擾物質(zhì)分離，其中，酯類(lèi)化合物的極性接近于白藜蘆醇，因此可用來(lái)進(jìn)行白藜蘆醇及其糖苷的萃取。乙酸乙酯萃取反式白藜蘆醇及其糖苷為甲酸乙酯的80%～92%，正丁酸乙酯萃取率為甲酸乙酯的30%～75%，萃取劑甲酸乙酯明顯優(yōu)于乙酸乙酯和正丁酸乙酯，萃取效果如圖3所示。

2.1.3萃取pH

以2 mol/L的鹽酸調(diào)整海紅果酒的pH，甲酸乙酯為萃取劑進(jìn)行液液萃取，白藜蘆醇具有三個(gè)酚羥基，在低pH的條件下，H+濃度增加，減少酚羥基的水解，降低其極性，有利于白藜蘆醇的有機(jī)溶劑萃取。試驗(yàn)結(jié)果如圖4，在pH=2時(shí)及反式白藜蘆醇及其糖苷提取量高，為最佳萃取pH。

圖4　不同pH對(duì)萃取效果的影響Fig.4Effect of different pH on the extraction of resveratrol and piceid

2.1.4萃取溫度

選取萃取溫度為4、10、20、30℃，甲酸乙酯為萃取劑進(jìn)行液液萃取，隨著溫度的降低，萃取率逐漸提高，白藜蘆醇微溶于水，溫度降低，溶解度隨之降低，提高了液液萃取的分配系數(shù)，增加了在有機(jī)相的分配。試驗(yàn)結(jié)果如圖5，在4℃條件下，反式白藜蘆醇苷提取量高，為最佳萃取溫度。

圖5　不同溫度對(duì)萃取效果的影響Fig.5Effect of different temperature on the extraction of resveratrol and piceid

2.1.5梯度洗脫程序

通過(guò)不同的梯度洗脫程序，對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)樣品、海紅果酒樣品進(jìn)行分離分析，從分離度、峰形、實(shí)際試樣的背景及分析時(shí)間等多因素考慮，最終確定的梯度洗脫程序如表1所示。

表1　梯度洗脫程序Table 1Program of gradient elution

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和檢測(cè)限

在選定的色譜條件下，反式白藜蘆醇及反式白藜蘆醇苷保留時(shí)間如圖6所示。

圖6　白藜蘆醇及白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.6Chromatogram of standard of resveratrol and piceid

在設(shè)定的色譜條件下，分別取20 μL系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分析。以反式白藜蘆醇及白藜蘆醇苷的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以檢出峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到回歸方程分別：

以S/N=3計(jì)算反式白藜蘆醇及反式白藜蘆醇苷的最低檢測(cè)限分別為0.28、0.36 ng/mL。

2.3精密度和加標(biāo)回收率

精密吸取反式白藜蘆醇苷和反式白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品混和液20 μL進(jìn)樣，對(duì)應(yīng)色譜峰面積（n=5）的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.12%、1.99%，反式白藜蘆醇及其糖苷的加標(biāo)回收率分別為98.6%、104.2%。

2.4海紅果酒中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的分析

取海紅果酒樣品按方法1.5所述處理后進(jìn)行高效液相色譜分析，結(jié)果如圖7，反式白藜蘆醇含量144.9 μg/L，反式白藜蘆醇苷含量58.9 μg/L。

圖7　海紅果酒中白藜蘆醇及白藜蘆醇苷的色譜圖Fig.7Chromatogram of resveratrol and piceid extracted from circassian fruit wine

3結(jié)論

1）直接進(jìn)樣雜質(zhì)峰多、分離度差、很難定量分析，預(yù)處理能最大限度地減少雜質(zhì)干擾，在樣品預(yù)處理中，殼聚糖脫色時(shí)隨溫度升高脫色效果增加，當(dāng)溫度超過(guò)35℃，脫色率下降，35℃為最佳脫色溫度。萃取劑的種類(lèi)和萃取條件對(duì)萃取效率的影響很大，甲酸乙酯的萃取效率優(yōu)于乙酸乙酯、正丁酸乙酯，但譜圖出峰較多。綜合分析甲酸乙酯為萃取劑在4℃、pH=2的條件為最佳的萃取條件。

2）采用乙腈和水作為流動(dòng)相，優(yōu)化梯度洗脫程序，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為306 nm。結(jié)果顯示基線(xiàn)穩(wěn)定、雜質(zhì)干擾峰少、分離度較好、精密度佳，適合海紅果酒中的白藜蘆醇及其糖苷的定量分析。

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HPLC Determination of Resveratrol and Piceid from Circassian Fruit Wine

DING Yong
（College of Life Science and Engineering，Shaanxi university of Science and Technology，Xi'an 710021，Shaanxi，China）

An analytical method of resveratrol and piceid that were extracted from circassian fruit wine was established.Through study of preprocessing and HPLC condition，the optimum pretreatment condition was as follows：decolorizingagentischitosan，pH2，andextractionsolventisethylformatethattreatssamplesat4℃，pH2.There were conditions of HPLC as follows：acetonitrile and water were adopted as mobile phase that conducts gradientelution，trans-resveratrolandtrans-piceidweredetectedatawavelengthof306nm.Theresultsappeared，in the selected condition，the recovery rate up to 98.6%-104.2%，the baseline smooth and precision well.This approachisqualifiedforquantitativeanalysisofresveratrolanditsglucosidefromcircassianfruitwine.

circassian fruit wine；resveratrol；piceid；HPLC

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.033

2014-05-04

丁勇（1974—），男（漢），講師，碩士，研究方向：發(fā)酵工程。