韓　娜　曹　江★

·論著·

抑制PAR4表達(dá)對(duì)腸癌細(xì)胞SW620藥敏性的影響

韓娜曹江★

目的 探討抑制PAR4表達(dá)對(duì)腸癌細(xì)胞SW620藥敏性的影響。方法 采用MTT法測(cè)定SW620細(xì)胞、空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞SW620/ pcDNA3.1（+）和針對(duì)人PAR4的人工microRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞SW620-m1、SW620-m2對(duì)腸癌臨床常用化療藥物5-氟尿嘧啶和順鉑的IC50，分析抑制PAR4的表達(dá)對(duì)SW620細(xì)胞藥物敏感性的影響。結(jié)果 與SW620和SW620/pcDNA3.1（+）兩組對(duì)照細(xì)胞相比，PAR4表達(dá)受抑制的SW620-m1、SW620-m2兩組細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的IC50均顯著升高（P＜0.01），對(duì)順鉑的IC50亦有明顯升高（P＜0.01，P＜0.05）。結(jié)論 抑制腸癌SW620細(xì)胞PAR4的表達(dá)將增加其對(duì)5-氟尿嘧啶和順鉑的耐受，提示以PAR4為靶點(diǎn)的腸癌聯(lián)合藥物治療研究需要綜合考慮用藥的合理性。

PAR4 表達(dá) 抑制 腸癌 藥敏

大腸癌是常見的惡性消化道腫瘤之一，化療是其主要的輔助治療手段［1，2］。蛋白酶激活受體（PARs）是一類帶有7個(gè)跨膜區(qū)的特殊的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR），其N末端被特異性蛋白酶裂解后成為自身配體，形成新的N-末端通過與受體本身的細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的一系列信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)而調(diào)控下游相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)（Figure 1）。由于包括各種PARs在內(nèi)的GPCR是較好的藥物作用靶點(diǎn)［3，4］，而且目前市場(chǎng)上暢銷的靶向治療藥物中約占40%的藥物是以各種GPCR為作用靶點(diǎn)［5］，因此以PARs為作用靶點(diǎn)進(jìn)行藥物開發(fā)研究具有重大意義。目前已明確PARs有4種，其中PAR4是近來新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)低親和力的凝血酶受體［6］。本資料在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上［7］，分析抑制PAR4表達(dá)對(duì)腸癌細(xì)胞SW620耐藥方面的影響。報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1材料 人體大腸癌細(xì)胞株SW620購自美國菌毒種保管中心（ATCC），由本實(shí)驗(yàn)室保存。小牛血清、RPMI1640等（Invitrogen公司），5-氟尿嘧啶（上海旭東海普藥業(yè)公司），順鉑（齊魯制藥有限公司），G418和MTT（AMRESCO公司產(chǎn)品）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 所有細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%小牛血清、100U/L青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、飽和濕度。

1.3PAR4表達(dá)抑制穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的建立 將在前期的研究中構(gòu)建針對(duì)PAR4基因的8個(gè)串聯(lián)連接的人工microRNA（8xPAR4-ami）表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的SW620細(xì)胞［7］，經(jīng)G418 （800μg/ml）篩選，2周后具有抗性的細(xì)胞株形成克隆后，在倒置顯微鏡下標(biāo)記，并分別轉(zhuǎn)移至24孔板繼續(xù)培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移至6孔板，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 （+）-8xPAR4-ami的兩株單克隆細(xì)胞命名為SW620-m1、SW620-m2。

1.4MTT法測(cè)定IC50 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以含10%小牛血清的RPMI1640調(diào)整細(xì)胞懸液以3×103個(gè)/孔的密度接種96孔板中，每種細(xì)胞做3個(gè)復(fù)孔，貼壁后，小心吸棄培養(yǎng)基，加入以10%小牛血清的RPMI1640配制的含5-氟尿嘧啶藥物濃度為31.25μg/ ml、15.625μg/ml、7.813μg/ml、3.906μg/ml、1.953μg/ ml、0.977μg/ml、0.488μg/ml、0.244μg/ml、0.122μg/ ml；順鉑的藥物濃度為25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ ml、3.125μg/ml、1.563μg/ml、0.781μg/ml、0.391μg/ ml、0.195μg/ml。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%CO2及飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)3d后，棄去培養(yǎng)基，干燥后用DMSO（200μl/孔）溶解結(jié)晶，在570nm處讀取吸光度值，計(jì)算相對(duì)抑制率（%）=（1-ODn/ODo）×100%（本實(shí)驗(yàn)ODn即為不同藥物濃度下的OD值，ODo為未加化療藥物的OD值），然后計(jì)算50%細(xì)胞抑制生長(zhǎng)所需的藥物濃度（IC50）。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1PAR4人工microRNA對(duì)SW620細(xì)胞中PAR4的表達(dá)抑制 提取轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）- 8xPAR4-microRNA的SW620組、空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的總蛋白，利用Western blot檢測(cè)其中PAR4表達(dá)水平，結(jié)果見圖1。從圖中可以看出轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒的SW620-m1、SW620-m2細(xì)胞株較空載體對(duì)照組和陰性對(duì)照組有明顯的抑制。

圖1　Western blot檢測(cè)各細(xì)胞株中PRR4的表達(dá)水平

2.2PAR4表達(dá)抑制對(duì)SW620細(xì)胞藥敏性的影響 轉(zhuǎn)染細(xì)胞組 SW620-m1、SW620-m2、空載組SW620/ pcDNA3.1（+）和對(duì)照組細(xì)胞SW620分別對(duì)順鉑、5-氟尿嘧啶的IC50值，結(jié)果顯示SW620-m1、SW620-m2與SW620/pcDNA3.1（+）細(xì)胞相比對(duì)順鉑的IC50有明顯差異（P＜0.01，P＜0.05）；SW620-m1、SW620-m2與SW620/pcDNA3.1（+）細(xì)胞相比對(duì)5-氟尿嘧啶的IC50均有明顯差異（P＜0.01），表明PAR4表達(dá)抑制能降低SW620細(xì)胞對(duì)順鉑、5-氟尿嘧啶的敏感性。見表1。

表1　PAR4表達(dá)抑制對(duì)SW620細(xì)胞藥敏性的影響（±s）

表1　PAR4表達(dá)抑制對(duì)SW620細(xì)胞藥敏性的影響（±s）

注：與 SW620比較，*P＜0.01；與SW620/pcDNA3.1（+）比較，#P＜0.01；

細(xì)胞株IC50（μg/ml）5-FuDDP SW6201.79±0.071.47±0.05 SW620/pcDNA3.1（+）1.83±0.151.47±0.02 SW620-m13.55±0.08*#2.46±0.25*# SW620-m23.28±0.03*#2.33±0.27*#

3　討論

腸癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素、多步驟影響的復(fù)雜過程。多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）是當(dāng)前治療腸癌的主要障礙。腸癌MDR的機(jī)制異常復(fù)雜，只有掌握腸癌耐藥的發(fā)生機(jī)制，才能有效干預(yù)耐藥的發(fā)生，并幫助建立耐藥逆轉(zhuǎn)策略。RNA干擾技術(shù)在腸癌MDR研究中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在細(xì)胞膜糖蛋白MDR1/P-gp、MDR相關(guān)蛋白（multidrug resistance associated protein，MRP）及相關(guān)酶類、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞凋亡調(diào)控基因等中的應(yīng)用［8，9］。研究發(fā)現(xiàn)抑制這些基因表達(dá)，能提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物水平，減少腫瘤藥物的排泄，并成功逆轉(zhuǎn)耐藥，恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，從而提高化療藥物的療效［10，11］。同時(shí)突變與功能缺失導(dǎo)致腸癌細(xì)胞引起化療誘導(dǎo)凋亡抑制與耐藥，p53基因是重要的抑癌基因，目前通過導(dǎo)入野生型p53基因［12］，能抑制細(xì)胞內(nèi)化療藥物的排出，從而提高對(duì)化療藥物的敏感性。

隨著對(duì)蛋白酶功能的深入研究，傳統(tǒng)的關(guān)于蛋白酶在腫瘤生長(zhǎng)、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中的作用觀點(diǎn)發(fā)生了巨大的變化。研究發(fā)現(xiàn)，某些蛋白酶，如凝血酶可以作為信號(hào)分子經(jīng)由蛋白酶活化受體PARs通過其偶聯(lián)的G蛋白酶引發(fā)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)。PAR4是新近發(fā)現(xiàn)的凝血酶受體，在不同的組織細(xì)胞中，PAR4的表達(dá)程度并不相同。PAR4在腸癌細(xì)胞的表達(dá)是上調(diào)的，雖然這一表達(dá)水平變化的具體原因及機(jī)制尚不明確，提示PAR4在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的上調(diào)可能與腫瘤細(xì)胞的各種惡性表型有一定的關(guān)系，隨著各種以GPCR為靶點(diǎn)的新型藥物的出現(xiàn)，靶向PAR4可以作為一種新的個(gè)體化治療手段進(jìn)行研究。

由于microRNA顯示了更好的穩(wěn)定性與基因沉默效果，作者采用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建了多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的PAR4的microRNA的真核表達(dá)載體特異性抑制結(jié)腸癌細(xì)胞PAR4的表達(dá)，分析PAR4表達(dá)抑制對(duì)腸癌細(xì)胞藥敏性的影響。本資料結(jié)果發(fā)現(xiàn)與SW620和SW620/pcDNA3.1（+）兩組對(duì)照細(xì)胞相比，PAR4表達(dá)受抑制的SW620-m1、SW620-m2兩組細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的IC50均顯著升高（P＜0.01），對(duì)順鉑的IC50亦有明顯升高（P＜0.01，P＜0.05）。表明抑制腸癌SW620細(xì)胞PAR4的表達(dá)將降低其對(duì)5-氟尿嘧啶和順鉑的敏感性。

Gratio V等［13］研究發(fā)現(xiàn)PAR4經(jīng)激活Erc、ErbB-2激酶促進(jìn)腸癌細(xì)胞的增殖，Mize GJ等［14］通過靶向PAR1、PAR2基因小分子干擾RNA抑制前列腺癌細(xì)胞DU-145、PC-3和LNCaP的生長(zhǎng)，可能與阻斷ERK1/2激酶有關(guān)。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)由于培養(yǎng)3d后，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組的細(xì)胞較轉(zhuǎn)染空載組細(xì)胞處于S、G2/M期的細(xì)胞數(shù)少，對(duì)化療藥的敏感性降低所致，其具體的機(jī)制尚有待于進(jìn)一步證實(shí)。

本資料數(shù)據(jù)結(jié)果提示今后以PAR4為靶點(diǎn)的腸癌聯(lián)合藥物治療研究需要綜合考慮用藥的合理性，聯(lián)合用藥時(shí)應(yīng)避開這些藥，或找到耐藥機(jī)制克服耐藥后再聯(lián)合用藥。這些結(jié)果為全面深入地研究PAR4對(duì)腸癌耐藥的影響和相關(guān)的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)，指導(dǎo)臨床采用有效的個(gè)體化療方案。

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Objective To explore the effect of PAR4 inhibition on sensitivity to chemotherapeutic drugs of human colorectal carcinoma SW620 cells. Methods MTT method was used to determine the half-inhibition concentration （IC50）to chemotherapeutic drugs that are commonly used in clinical treatment of colorectal cancer 5-Fu and DDP for human colorectal carcinoma SW620 cells，vector-alone transfected SW620 cells and PAR4-targeting artifi cial microRNA-expressing vector transfected SW620-m1 and SW620-m2 cells. Results Compared with parental cell line SW620 and vector control SW620/pcDNA3.1（+）cells，the SW620-m1 and SW620-m2 cell line with inhibited PAR4 expression exhibited signifi cantly increased IC50 for 5-Fu（P＜0.01）and DDP（P＜0.01，P＜0.05）. Conclusions Inhibition of PAR4 expression in SW620 cells leads to the increase of drug resistance to 5-Fu and cisplatin，which suggests that reasonableness should be considered when conducting investigation on combination of PAR4-targeting therapy with other chemotherapeutic drugs for colorectal cancer treatment.

PAR4 Expression Inhibition Colorectal cancer Drug sensitivity

國家自然科學(xué)基金（30271450，30672365）

310022浙江省腫瘤醫(yī)院化療中心（韓娜）310009 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院臨床研究中心（曹江）*通訊作者