胡珺婷　楊向軍★

PCI術(shù)后高血小板反應(yīng)與CYP2C19基因多態(tài)性關(guān)系的分析

胡珺婷楊向軍★

目的 觀察經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入（PCI）術(shù)后使用氯吡格雷6個(gè)月后其高血小板反應(yīng)發(fā)生率及其與CYP2C19基因多態(tài)性的關(guān)系。方法 入選2012年6月至9月行PCI治療的冠心病患者47例，術(shù)前頓服氯吡格雷300mg、阿司匹林300mg負(fù)荷劑量，術(shù)后予維持劑量治療。檢測術(shù)后6個(gè)月最大血小板聚集率（MPA），直接測序法檢測CYP2C19基因多態(tài)性。將觀察對(duì)象分為血小板高反應(yīng)性（HPR）組和非血小板高反應(yīng)性（nHPR）組，檢測血細(xì)胞計(jì)數(shù)、纖維蛋白原、超敏CRP等及CYP2C19基因多態(tài)性與HPR的關(guān)系。結(jié)果 HPR17例，nHPR 30例。CYP2C19基因表型強(qiáng)代謝者21例，一般代謝者18例，弱代謝者8例。HPR組，EMs6例（35.3%），IMs6例（35.3%），PMs5例（29.4%）；nHPR組，EMs15例（50.0%），IMs12例（40.0%），PMs3例（10.0%）。HPR、nHPR組2μmol/L、5μmol/L ADP誘導(dǎo)MPA比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。EMs、IMs、PMs組間MPA、HPR比較有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 PCI術(shù)后患者中接受氯吡格雷治療的HPR普遍存在。CYP2C19基因檢測相關(guān)代謝型與HPR無明確相關(guān)性。

氯吡格雷 高血小板反應(yīng) 基因多態(tài)性 冠心病

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入（PCI）已于臨床廣泛開展，雙聯(lián)抗血小板治療改善長期預(yù)后［1］。氯吡格雷抗血小板效果欠佳，稱之為治療中血小板高反應(yīng)性（HPR）或氯吡格雷抵抗（CR）［2］。其發(fā)生機(jī)制尚未闡明，氯吡格雷代謝基因多態(tài)性可能是其重要機(jī)制之一。研究表明CYP2C19同工酶基因的單核苷酸多態(tài)性與氯吡格雷產(chǎn)生不同程度抗血小板水平密切相關(guān)［3］。針對(duì)CYP2C19基因多態(tài)性表達(dá)，中長期HPR仍未知。本資料擬探討PCI術(shù)后6個(gè)月不同氯吡格雷代謝型與HPR關(guān)系，進(jìn)一步指導(dǎo)合理用藥。

1　臨床資料

1.1一般資料 選取2012年6月至9月間本院收治的冠心病患者47例，其中男38例，女9例；平均年齡（61.60±11.85）歲。術(shù)后定期隨訪，6個(gè)月測定最大血小板聚集率（MPA），根據(jù)MPA值分為HPR組（n=17）和非血小板高反應(yīng)性（nHPR）組（n=30）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＞18周歲。（2）符合冠心病的入選標(biāo)準(zhǔn)，行PCI介入治療，植入雷帕霉素藥物洗脫支架。（3）住院期間觀察項(xiàng)目、指標(biāo)及病史資料記錄完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）對(duì)阿司匹林、氯吡格雷或低分子肝素過敏或不能耐受。（2）近期有活動(dòng)性出血史，明顯肝腎功能、凝血功能異常。（3）心臟瓣膜病、心肌炎、先天性心臟病、感染性心內(nèi)膜炎患者等。兩組年齡、性別、吸煙、合并高血壓、糖尿病、高脂血癥等組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2方法 入選患者PCI術(shù)前根據(jù)病情予頓服負(fù)荷劑量拜阿司匹林300mg、波立維（硫酸氫氯吡格雷）300mg。根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影確定PCI方案，所有PCI操作均依據(jù)現(xiàn)行指南為參照標(biāo)準(zhǔn)。術(shù)中、術(shù)后是否使用低分子肝素、GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑取決于手術(shù)醫(yī)生的病情判斷。術(shù)后維持劑量拜阿司匹林100mg，1次/d，波立維75mg，1次/d，雙聯(lián)抗血小板治療≥1年。PCI術(shù)后通過電話、門診等方式對(duì)入選患者隨訪12個(gè)月，記錄患者病情變化。術(shù)后6個(gè)月采血檢測CYP2C19 *2、*3 基因多態(tài)性，血小板聚集率等。

1.3血小板聚集功能測定 采用比濁法測定血小板聚集率，囑患者空腹，取靜脈血5ml于檸檬酸鈉抗凝管中。血標(biāo)本在2h內(nèi)完成檢驗(yàn)。取檸檬酸鈉抗凝血5ml以800r/min離心5min，吸取上層血漿為富血小板血漿（PRP）。將去PRP血漿的剩余全血以3500r/min離心10min，上清液即為貧血小板血漿（PPP）。制備終濃度為2μmol/L、5μmol/L ADP誘導(dǎo)劑。將300μl PPP加入比色杯內(nèi)，插入比色孔，進(jìn)行調(diào)零。取出比色杯，加入300μl PRP及攪拌子1個(gè)，插入比色孔，每個(gè)比色杯內(nèi)各加入2μl的ADP誘導(dǎo)劑。每加1個(gè)ADP即按相應(yīng)序號(hào)鍵開始檢驗(yàn)。同理進(jìn)行5μlADP誘導(dǎo)劑的血小板聚集率測定。血小板聚集反應(yīng)檢測持續(xù)5min，報(bào)告參數(shù)包括60s、120s、180s 血小板聚集率（PA）及MPA。以上檢測在普利生血小板聚集儀上進(jìn)行。

1.4基因分析 空腹用EDTA抗凝管抽取3ml靜脈血，采用直接測序法檢測CYP2C19 *2、*3 SNP基因多態(tài)性，具體步驟包括樣本DNA抽提-PCR擴(kuò)增-PCR擴(kuò)增子消化（蝦堿酶）-測序PCR反應(yīng)并純化擴(kuò)增產(chǎn)物-測序儀檢測-分析結(jié)果、得出報(bào)告。檢測人基因組CYP2C19*2和CYP2C19*3，CYP2C19基因型包括：野生型：CYP2C19 *1/*1。突變雜合型：CYP2C19 *1/*2、*1/*3。突變純合型：CYP2C19 *2/*2、*3/*3、*2/*3。表現(xiàn)型：強(qiáng)代謝者（EMs）：CYP2C19 *1/*1；一般代謝者（IMs）： CYP2C19 *1/*2、*1/*3；弱代謝者（PMs）：CYP2C19 *2/*2、*3/*3、*2/*3。

1.5基線資料收集 所有觀察對(duì)象均記錄：（1）基本信息如性別、年齡、體重指數(shù)等；既往病史如糖尿病、高血壓病等。（2）實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢查項(xiàng)目如白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、血小板計(jì)數(shù)、膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、血肌酐、尿素氮、纖維蛋白原、超敏C反應(yīng)蛋白、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）值等。（3）PCI手術(shù)情況如病變血管、處理血管、藥物涂層支架（DES）植入類型、數(shù)量、TIMI分級(jí)等臨床資料。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA）。計(jì)數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1冠狀動(dòng)脈造影情況及PCI治療特征 入選觀察對(duì)象均行PCI治療，冠狀動(dòng)脈造影顯示病變血管、處理血管及植入支架數(shù)目、長度、直徑等指標(biāo)，結(jié)果顯示HPR組植入DES長度、直徑、數(shù)量均高于nHPR組，但兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1　接受PCI治療患者手術(shù)情況（±s）

表1　接受PCI治療患者手術(shù)情況（±s）

變量HPR組（n=17）nHPR組（n=30）DES長度（mm）21.00±4.2918.57±5.65 DES直徑（mm）2.89±0.372.86±0.39 DES植入數(shù)量（枚）1.24±0.441.17±0.38病變血管（根）1.29±0.591.60±0.77前降支（LAD）［n（%）］14（70.0）17（51.5）左回旋支（LCX）［n（%）］2（10.0）9（27.3）右冠狀動(dòng)脈（RCA）［n（%）］4（20.0）7（21.2）TIMI分級(jí)-Ⅲ級(jí)［n（%）］13（76.5）26（86.7）

2.2CYP2C19基因多態(tài)性 根據(jù)納入觀察范圍47例的CYP2C19基因多態(tài)性檢測，CYP2C19野生型（*1/*1）21例，CYP2C19*2純和突變型（*2/*2）6例，CYP2C19*3純和突變型（*3/*3）2例，CYP2C19*2雜合突變型（*1/*2）14例，CYP2C19*3雜合突變型（*1/*3）4例。根據(jù)是否攜帶CYP2C19 LOF基因，分組EMs 21例，IMs 18例，PMs 8例。

2.3組間HPR、CYP2C19分布及MPA比較 （1）根據(jù)HPR分組：定義HPR為MPA≥46%［4］，發(fā)生HPR17例、nHPR30例。HPR組，EMs6例（35.3%），IMs 6例（35.3%），PMs 5例（29.4%）。nHPR組，EMs15例（50.0%），IMs12例（40.0%），PMs3例（10.0%）。HPR組與nHPR組2μmol/LADP誘導(dǎo)MPA為（43.15±9.90）vs（28.43±7.48），5μmol/LADP誘導(dǎo)MPA為（52.92±6.75）vs（35.33±7.00），組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（2）根據(jù)CYP2C19表型分組：比較CYP2C19不同基因表型間MPA，EMs（n=21）、IMs（n=18）、PMs（n=8），以2μmol/ L、5μmol/L ADP誘導(dǎo)MPA分別為（30.53±7.79）vs（34.59±11.23）vs（41.09±14.95），（39.91±9.54）vs（41.97±9.73）vs（46.57±16.14）。HPR發(fā)生率分別為28.6%、33.3%、62.5%，P=0.251。隨訪期間各組均無主要心血管事件（MACE）發(fā)生，EMs因冠心病癥狀再住院2例（9.5%），PMs再住院2例（25.0%），IMs無再住院。組間MPA、HPR發(fā)生及再住院率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3　討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)約有1/3服用氯吡格雷的冠心病患者存在HPR［5］。研究指出在氯吡格雷負(fù)荷劑量后發(fā)現(xiàn)HPR存在對(duì)PCI術(shù)后短期、長期預(yù)后有一定影響，尤其早期血栓形成［6］。Cuisset等［7］提出在氯吡格雷負(fù)荷劑量后，將即刻評(píng)價(jià)氯吡格雷反應(yīng)作為長期預(yù)后指標(biāo)之一不可靠。利用血小板功能檢測、基因檢測對(duì)氯吡格雷反應(yīng)做出評(píng)價(jià)是有其價(jià)值的，但檢測必要性、如何檢測、何時(shí)檢測及其有效性等基本問題仍有較大爭議。

本資料發(fā)現(xiàn)，PCI術(shù)后6個(gè)月后HPR在EMs、IMs、PMs各組發(fā)生有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。分析原因包括：目前絕大多數(shù)為圍手術(shù)期研究，ACS患者圍手術(shù)期冠狀動(dòng)脈血管壁損傷嚴(yán)重，持續(xù)血小板激活、血栓負(fù)荷重等因素持續(xù)作用，術(shù)前氯吡格雷負(fù)荷劑量頓服后，吸收至其抗血小板作用完全發(fā)揮時(shí)間大約6h，加之GPⅡb/Ⅲa受體抑制劑等強(qiáng)化抗血小板藥物的應(yīng)用，前后MPA改變可能較為明顯。CYP2C19作為氯吡格雷在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性代謝物的重要肝酶代謝基因，雖然CYP2C19野生型理論上無氯吡格雷代謝障礙，但仍可能存在HPR；而攜帶CYP2C19 LOF突變基因亦有可能達(dá)到預(yù)期抗血小板水平。本資料CYP2C19突變比例與目前多數(shù)研究基本一致，不排除雖為突變型，但因其他CYP同工酶代謝代償而達(dá)到預(yù)期抗血小板作用水平。

研究表明CYP2C19 LOF基因突變患者，MACE發(fā)生率有所上升［8］。研究［9］表明，CYP2C19 *2的患者在接受75mg氯吡格雷維持量（MD）治療時(shí)，30%存在HPR，但同樣基因條件下，接受10mg普拉格雷MD治療則未出現(xiàn)HPR，提示改變藥物種類，使用新型抗血小板藥物等臨床干預(yù)，可能改善預(yù)后及轉(zhuǎn)歸。ACCF/AHA心肌梗死診治指南將第三代噻吩吡啶類藥物普拉格雷及替格瑞洛作為抗血小板藥物Ib類推薦，氯吡格雷則因存在HPR、起效時(shí)間較長等問題降為Ic類推薦。

基于抗血小板抗栓治療在心血管病領(lǐng)域的重要意義，尤其對(duì)PCI術(shù)后的患者改善長期預(yù)后作用，基因檢測與血小板功能檢測的實(shí)際價(jià)值亟需更大規(guī)模、更深入的研究進(jìn)一步證實(shí)。

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Objective We aimed to investigate the relationship between cytochrome （CYP）2C19 *2，*3 polymorphisms and high ontreatment platelet reactivity （HPR）in patients treated with percutaneous coronary interventions （PCI）and dual antiplatelet therapy over a 6-month period. Methods Totally 47 patients post-PCI were enrolled from June 2012 to September 2012. Patients received a 300mg loading dose（LD）clopidogrel and aspirin before PCI，then continued with maintenance dose（MD）as dual antiplatelet therapy. Max platelet aggregation（MPA）was assessed in post-PCI patients after 6 months. Direct sequence was used to genotype the CYP2C19*2、CYP2C19*3 polymorphisms in these patients. HPR was defi ned as MPA≥46%，whereas those having＜46% were nHPR. According to CYP2C19 polymorphism，we examined MPA and HPR in different phenotype. Results HPR was present in 36.2% patients. The phenotype of CYP2C19 includes EMs 44.7% （n=21），IMs 38.3%（n=18）and PMs 17.0% （n=8）. In HPR group and nHPR group，there were EMs 35.3% （n=6），50.0% （n=15），IMs 35.3% （n=6），40.0% （n=12），PMs 29.4% （n=5），10.0% （n=3），respectively. There’s no statistic differences among EMs、IMs、PMs in MPA and HPR distribution.Conclusion HPR is common in patients received clopidogrel after PCI. There is no substantial interaction between CYP2C19 polymorphism and platelet reactivity on clopidogrel.

Clopidogrel High on-treatment platelet reactivity CYP2C19 Polymorphisms Coronary heart disease