王芝芩

桂枝芍藥知母湯對CIA大鼠外周血TNF-α IL-17和IL-10的影響

王芝芩

目的 觀察桂枝芍藥知母湯對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的作用，探討類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制及桂枝芍藥知母湯的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。方法 應(yīng)用牛Ⅱ型膠原蛋白，建立膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠模型。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗方法（ELISA）檢測正常對照組、CIA模型組、醋酸潑尼松組和桂枝芍藥知母湯組大鼠血液TNF -α、IL-17和IL-10的濃度。用桂枝芍藥知母湯治療CIA大鼠，觀察治療過程中大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度及關(guān)節(jié)炎指數(shù)。結(jié)果 ELISA檢測結(jié)果顯示，CIA大鼠模型組血清TNF-α、IL-17含量明顯升高，而IL-10的含量明顯下降；桂枝芍藥知母湯組TNF-α、IL-17濃度下降，使之趨向正常，而IL-10的濃度上升，同時大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度減輕，關(guān)節(jié)炎指數(shù)下降。結(jié)論 桂枝芍藥知母湯可通過下調(diào)CIA大鼠外周血TNF-α、IL-17水平，上調(diào)CIA大鼠外周血IL-10水平，調(diào)節(jié)其免疫狀態(tài)，以達(dá)到治療CIA的作用。

桂枝芍藥知母湯 膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎 TNF-α IL-17 IL-10

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以侵蝕性、對稱性多關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的慢性、全身性自身免疫性疾病?；静±砀淖兪腔ぱ住⒀荇栊纬?。免疫紊亂是RA的主要發(fā)病機(jī)制。TNF-α、IL-17是RA發(fā)生炎癥時主要致炎因子，而IL-10是其主要抑炎因子，致炎因子（TNF-α、IL-17）與抑炎因子（IL-10）表達(dá)失衡，可能在CIA發(fā)病過程中具有重要作用。通過抑制TNF-α、IL-17活性，提高IL-10活性，以達(dá)到免疫平衡，有助于控制RA病情進(jìn)展［1］。作者自2014年5月至12月以桂枝芍藥知母湯對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen - inducing arthritis，CIA）大鼠外周血TNF-α、IL-17和IL-10的影響進(jìn)行了實驗研究。報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物 健康雌性Wistar大鼠60只，體重（110±10）g，SPF級，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2實驗材料 桂枝芍藥知母湯（桂枝、知母、防風(fēng)各12g，白芍9g，甘草、麻黃、炮附子各6g，生姜、白術(shù)各10g）由本院制劑室煎藥完成。牛Ⅱ型膠原（Chondrex公司）；不完全弗氏佐劑（Chondrex公司）；冰醋酸（杭州化學(xué)試劑有限公司）；檢測大鼠TNF-α、IL-17、IL-10 的ELISA試劑盒（上海森雄科技實業(yè)有限公司）。

1.3模型建立與分組 在無菌條件下，將冰醋酸（0.1mol/L）于冰浴中充分溶解牛Ⅱ型膠原（bovine collagen type Ⅱ，BCⅡ），濃度為4mg/ml，放置4℃冰箱過夜后，與弗氏不完全佐劑（incomplete Freund's adjuvant，IFA）等體積混合、振蕩乳化，制成BCⅡ乳劑，濃度為2mg/ml，放置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。參照文獻(xiàn)［2］的造模方法，對造模組大鼠尾根部進(jìn)行皮內(nèi)注射以致初次免疫，總量0.5ml。正常組注射0.5ml生理鹽水。于初次免疫2周后進(jìn)行二次免疫，總量0.3ml，方法同前。60只Wistar大鼠隨機(jī)選取10只為正常對照組（正常組），對其余50只大鼠進(jìn)行CIA模型建立（其中20只大鼠造模不成功）。選取造模成功大鼠30只，隨機(jī)分為3組：模型組10只、醋酸潑尼松組10只（潑尼松組），桂枝芍藥知母湯組10只（中藥組）。

1.4模型成功判定標(biāo)準(zhǔn) 致炎前，以足趾容積測量儀對每只大鼠左后足足趾容積進(jìn)行測量，作為致炎前足趾基礎(chǔ)容積。每周評分關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）。于首次注射BCⅡ乳劑21d后，根據(jù)關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）評分來評判模型成功［3］。

1.5給藥方法 給藥時間于造模成功后開始，潑尼松組予醋酸潑尼松5.0mg/（kg·d）的劑量標(biāo)準(zhǔn)灌胃，中藥組大鼠予桂枝芍藥知母湯22.9g/（kg·d）的劑量標(biāo)準(zhǔn)灌胃，正常組、模型組灌胃等量生理鹽水，均1次/ d；連續(xù)給藥30d。

1.6外周血采集 眼眶取血2ml，靜置2h，以3000r/ min離心5min，取上清液作為外周血檢測標(biāo)本，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7觀測指標(biāo) （1）足趾腫脹度：采用足趾容積測量儀測量各組大鼠左后足足趾容積，觀察足趾腫脹度。測量位置：以無毛區(qū)為標(biāo)記線，即測量標(biāo)記線以下的足趾容積（ml）；測量時間：第21天（造模成功）、第35天（造模成功后2周）、第49天（造模成功后4周），記錄數(shù)據(jù)。（2）外周血TNF -α、IL-17、IL-10水平檢測：采用EL ISA法測定，具體操作按試劑盒說明書要求進(jìn)行。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠足趾腫脹度比較 與正常組比較，模型組、潑尼松組、中藥組大鼠足趾腫脹明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，潑尼松組、中藥組大鼠足趾腫脹度明顯減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與治療前比較，潑尼松組、中藥組大鼠足趾腫脹度均明顯減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

表1　各組大鼠足趾腫脹度比較（±s）

表1　各組大鼠足趾腫脹度比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與治療前比較，△P＜0.01

組別n治療前治療后中藥組104.545±0.347*2.280±0.785*#△潑尼松組104.536±0.255*2.154±0.753*#△模型組104.786±0.713*4.920±0.879*正常組101.260±0.5501.252±0.884

2.2各組大鼠外周血TNF-α、IL-17、IL-10水平比較 與正常組比較，模型組大鼠外周血TNF-α、IL-17水平顯著升高，IL-10水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，潑尼松組和中藥組外周血TNF-α、IL-17水平顯著性降低，IL-10水平上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

表2　各組大鼠外周血TNF-α、IL-17和IL-10水平比較（±s）

表2　各組大鼠外周血TNF-α、IL-17和IL-10水平比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01

組別nTNF-α（pg/ml）IL-17（pg/ml）IL-10（pg/ml）中藥組1012.68±2.37#13.49±0.16#9.49±0.27#潑尼松組1013.18±1.43#12.18±2.45#10.18±2.35#模型組1023.18±2.21*30.42±0.62*5.09±0.65*正常組104.49±0.855.27±0.755.19±0.81

3　討論

RA屬于中醫(yī)痹證范疇。桂枝芍藥知母湯原方出自《金匱要略·中風(fēng)歷節(jié)病脈證治》，該方是治療RA的常用方劑，具有祛風(fēng)寒除濕、溫陽通痹等作用。現(xiàn)代研究表明，桂枝芍藥知母湯具有較強(qiáng)的消炎鎮(zhèn)痛和免疫調(diào)節(jié)作用［4，5］。

Ⅱ型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型是 TrenthamDE等于1977年創(chuàng)立［6］。由于其在主要組織相容性復(fù)合物、關(guān)節(jié)局部病變、性別、collagen Ⅱ（C Ⅱ）自身免疫等方面與RA有較多相似之處，所以CIA模型是目前比較公認(rèn)的RA動物模型［7］。在實驗中，造模后第21天，造模組大鼠關(guān)節(jié)腫脹明顯，通過足趾容積評估及AI評分測量后，提示CIA模型制備成功。

在RA病理過程中，細(xì)胞因子異常產(chǎn)生及其相互作用在RA病程中起著非常重要的作用。這些細(xì)胞因子根據(jù)其性質(zhì)可分為兩大類，即促炎細(xì)胞因子和抑炎細(xì)胞因子。在正常情況下，促炎因子和抑炎因子處于一個平衡狀態(tài)，如有外界因素打破這種平衡，則會引發(fā)關(guān)節(jié)炎癥。大量研究表明RA發(fā)病中Th1細(xì)胞起重要作用，Th1主要分泌TNF-α、IL-2、IFN-γ，其中TNF-α是RA炎癥過程中主要的破壞性細(xì)胞因子，可促進(jìn)破骨細(xì)胞的溶骨作用，從而造成關(guān)節(jié)畸形；另外，TNF-α對創(chuàng)傷局部血管也有激活和損傷作用，可造成血管內(nèi)皮細(xì)胞在形態(tài)和功能上發(fā)生變化，增高其通透性，從而加重局部組織炎性細(xì)胞浸潤和炎性水腫。IL-17主要由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生，具有強(qiáng)大的致炎作用能刺激成纖維細(xì)胞分泌IL-6、IL-8、GM-CSF等炎癥因子，抑制軟骨細(xì)胞合成基質(zhì)，增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性，與TNF-α協(xié)同參與骨侵蝕。而IL-10是重要抗炎Th2型細(xì)胞因子，主要通過抑制核因子KB進(jìn)而抑制Thl細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-2、IFN-γ；可下調(diào)抗原遞呈細(xì)胞功能，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶生成，抑制IL-17等致炎因子的功能和生成，從而抑制RA關(guān)節(jié)炎炎癥，控制或阻止軟骨及骨的破壞。

本實驗結(jié)果表明，CIA大鼠外周血TNF-α、IL-17表達(dá)水平升高，抑炎因子IL-10表達(dá)顯著受抑；并且增高的TNF-α和IL-17與炎癥指數(shù)呈正相關(guān)，而降低的IL-10水平與炎癥指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。給予桂枝芍藥知母湯干預(yù)治療后，TNF-α、IL-17表達(dá)水平下降，而IL-10表達(dá)水平上升，說明桂枝芍藥知母湯能減少TNF-α、IL-17的生成，增加IL-10的生成，從而抑制炎性細(xì)胞的浸潤，減少關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和逆轉(zhuǎn)疾病的發(fā)展。這可能是桂枝芍藥知母湯治療CIA的作用機(jī)制之一，其治療CIA的其他機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

1 宋光，裘紅梅.膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中TNF-α、IL-17及IL-10水平分析.大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，34（5）：492～494.

2 沃格爾HG，沃格爾WH.藥理學(xué)實驗指南-新藥發(fā)現(xiàn)和藥理學(xué)評價.北京：科學(xué)出版社，2001.577～589.

3 Carter RA，Campbell IK，O’Donnell K，et al.Vascular cell adhesion molecule-1（VCAM-1）blockade in collagen-induced arthritis reduces joint in vlovement and alters B cell trafficking.Clin Exp Immunol，2002，128（1）：44～51.

4 徐春元.桂枝芍藥知母湯聯(lián)合云克治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活動期的臨床觀察. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，33（8）：19～20.

5 陳劍梅，金實.金實教授運用桂枝芍藥知母湯治療活動期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎經(jīng)驗.中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（12）：3138～3140.

6 Feng H，Yamaki K，Takano H，et al.Suppression of Thl and Th2 immune responses in mice by sinomenine an alkaloid extracted from the Chinese medicinal plant Sinomenium acutum.Planta Medica，2006，72（15）：1383～1388.

7 Chie O，Yoriaki K，Yoji M，et al.Resistance to collagen-induced arthritis in SHPS-1 mutant mice.Biochem Biophys Res Commun，2008，371（3）：561～566.

Objective To explore the effect of Guizhishaoyaozhimu Tang on TNF-α，IL-17 and IL-10 in the rats of collagen - inducing arthritis（CIA）. Methods The cow Ⅱ type collagen was applied forthe establishment of collagen induced arthritis（collagen - induced arthritis and the CIA）model in rats. Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was used to detect observation of normal control group，model group，the CIA prednisone acetate group and cassia twig peony rhizoma anemarrhenae decoction group rats blood TNF alpha，IL-17 and the concentration of IL-10. The CIA rats treated with Guizhishaoyaozhimu Tang，treatment process index such as joint swelling degree and arthritis were observed and recorded. Results The ELISA test results show that the CIA model group rats serum TNF alpha，IL-17 levels increased signifi cantly，while the content of IL-10 drops obviously；in Guizhishaoyaozhimu Tang group， the level of TNF alpha andIL - 17 concentration decreased，making it tend to norm，while the rise in the concentration of IL - 10，joint swelling of rats were alleviated at the same time，the arthritis index fell. Conclusion Guizhishaoyaozhimu Tang can decrease the level of TNF alpha，IL-17and increase the levels of IL - 10 in CIA rat peripheral blood，adjust the immune status，therefore t for the treatment of the CIA.

Guizhishaoyaozhimu Tang CIA TNF-α IL-17 IL-10

310053浙江中醫(yī)藥大學(xué)（在職研究生）

311501 浙江省桐廬縣第一人民醫(yī)院